工程化大肠杆菌Nissle 1917高效代谢支链氨基酸的活体生物治疗剂设计与药效学研究

　　本研究报告了两种基于合成生物学改造的工程菌株（ECN-Deg与ECN-Tra），通过整合支链氨基酸（BCAAs）降解与转化模块，实现在体外和体内高效代谢BCAAs。研究证实工程菌可显著减轻高BCAAs小鼠模型的肝脏与回肠损伤，降低全身炎症水平，并调控肠道菌群富集有益微生物（如Akkermansia muciniphila）。该研究为治疗BCAAs代谢紊乱及相关慢性疾病提供了新型益生菌干预策略。

　　

工程菌株的设计与构建

研究以大肠杆菌Nissle 1917（ECN）为底盘菌，通过合成生物学手段构建了两种高效代谢支链氨基酸（BCAAs）的工程菌株：ECN-Deg与ECN-Tra。ECN-Deg整合了BCAAs从头降解模块（Deg Module），包含分支链氨基酸转运蛋白BrnQ、来自乳酸乳球菌的酮酸脱羧酶KdcA以及内源性转录激活因子PrpR，用于增强丙酰辅酶A的分解代谢。ECN-Tra则采用转化策略（Tra Module），通过BrnQ和来自产孢梭菌的丙酮酸黄素氧还蛋白氧化还原酶（Por）将BCAAs直接转化为短链脂肪酸（SCFAs）。为进一步增强菌株对BCAAs的代谢需求，研究人员敲除了内源性BCAAs合成途径相关基因（ilvC、ilvI和lrp），显著提升了工程菌对BCAAs的利用能力。

体外代谢效能评估

通过体外培养实验发现，在M9培养基中添加30 mM BCAAs的条件下，经阿拉伯糖（Ara）诱导后，ECN-Deg和ECN-Tra表现出最强的BCAAs降解能力，24小时内分别消耗了8.414 ± 0.051 mM和9.146 ± 1.019 mM的BCAAs。定量PCR和Western blot分析证实，目标基因在转录和翻译水平均高效表达。在模拟肠液（SIF）环境中，两株工程菌能快速代谢BCAAs，并在缺乏外源碳源时停止增殖，表现出良好的代谢可控性。

体内分布与药代动力学

利用荧光素酶报告系统（pBAD-luxCDABE）进行体内追踪，发现工程菌在灌胃后0.5小时到达空肠，1小时后主要富集于回肠，4小时后进入盲肠，最终通过结肠排泄。菌株在肠道内的滞留时间约为48小时。通过¹³C标记BCAAs的实验，研究首次证实了BCAAs存在肠-血循环现象，为工程菌持续利用血液中的BCAAs提供了理论依据。

急性与慢性模型中的治疗效果

在高BCAAs急性模型中，ECN-Deg和ECN-Tra干预显著降低了小鼠血浆和粪便中的BCAAs水平，并缓解了回肠绒毛的炎症损伤。在30天的长期干预实验中，工程菌处理组小鼠的肝脏功能指标（ALT、AST）显著改善，系统性炎症因子（IL-6、TNF-α、CXCL1等）水平恢复正常。组织学分析显示，工程菌有效减轻了BCAAs引起的肝细胞气球样变性和回肠绒毛结构破坏。

肠道菌群调控作用

16S rRNA测序分析表明，ECN-Deg和ECN-Tra能显著逆转高BCAAs引起的肠道菌群失调。尤其值得注意的是，ECN-Tra处理后有益菌Akkermansia muciniphila、Mucispirillum schaedleri和Paramuribaculum intestinale的丰度显著上升，而致病菌Streptococcus pasteurianus的丰度下降。这种调控作用可能与ECN-Tra产生的SCFAs促进益生菌定植有关。

分子机制与信号通路

转录组分析发现，工程菌中与能量代谢相关的通路（如核糖体和TCA循环）显著富集，表明BCAAs的高效降解需要额外的能量供应。Western blot验证了Deg模块中的KdcA、BrnQ、PrpR蛋白以及Tra模块中的Por蛋白在肠道环境中均能稳定表达。

治疗潜力与转化意义

该研究开发的工程菌株为治疗枫糖尿症（MSUD）等BCAAs代谢障碍疾病提供了非饮食干预的新策略。通过肠道局部代谢BCAAs，不仅降低了全身性BCAAs负荷，还通过产生SCFAs和调控菌群产生了多重健康效益。研究团队还特别强调了工程菌的生物安全性，包括采用温度敏感型质粒系统和避免长期定植的设计。

局限性与未来方向

当前研究尚未直接测定细胞内BCAAs浓度及异源酶的精确动力学参数。质粒表达系统的遗传稳定性与安全性仍需通过染色体整合等策略进一步优化。此外，工程菌诱导的菌群变化（如A. muciniphila的富集）的长期效应有待进一步评估。