组织工程构建全层人尿道替代物的体外生成与特性表征：迈向仿生修复严重尿道病变的新突破

　　本刊推荐：本研究首次通过组织工程技术成功构建出包含黏膜层（UM）、海绵体层（SP）和白膜层（AL）的全层人尿道替代物（FHUS）。该仿生结构显著改善了单层组织的生物力学性能，并表达关键上皮标志物（CK7/CK14/UPK1b）、细胞连接蛋白（DSP/TJP1/Claudin）及基底膜成分（胶原IV/层粘连蛋白）。虽然其力学强度未达天然尿道水平，但为严重尿道病变的临床修复提供了具有转化潜力的新型组织工程解决方案。

　　

Abstract

组织工程技术为人类尿道严重病变的外科修复提供了潜在的有效替代方案。然而，管状全层替代物的开发仍面临重大挑战。本研究通过体外生成并评估了一种新型全层人尿道替代物（FHUS），其包含尿道的三个主要层次：尿道黏膜（UM）、海绵体层（SP）和白膜（AL）。研究首先表明，与单层组织相比，FHUS的生成显著改善了这种人工组织的生物力学性能，尽管未达到天然尿道的抵抗强度。在结构水平上，发现FHUS与天然尿道具有重要的组织学相似性。

1 INTRODUCTION

人类尿道是一个复杂的管状器官，主要包括与尿道腔直接接触的尿道黏膜（UM）、海绵体层（SP）和包围SP的外部白膜层（AL），尤其在男性中这些结构更为发达，尽管女性的一些结构发育较差。UM由复层非角化鳞状上皮及其下方的基质层组成。这种多层结构可能因多种原因受损，导致人类尿道功能障碍。

虽然尿道的严重疾病并不非常普遍，但影响该结构的疾病难以处理。儿科患者中大多数结构性尿道疾病与先天性畸形有关，如尿道下裂和尿道上裂，而成人患者的尿道疾病通常与尿道狭窄以及与创伤、医源性原因、感染和肿瘤相关的尿道缺陷有关。当前治疗主要基于尿道成形术手术矫正尿道缺陷，该手术通常依赖于组织瓣或自体移植物，但这些并不总是可用。遗憾的是，该手术的结果仍不理想，特别是在大段尿道缺损病例中，因此需要能够改善这些结果的新治疗方法。

在此背景下，组织工程生成的人类生物人工组织和器官先前已被证明可能用于临床治疗影响人体不同器官的严重疾病。基于人类细胞与生物材料和生长因子的结合，组织工程产生的生物人工组织应具有生物相容性，并能仿生再现天然组织的结构和组成。最近研究表明，使用高生物相容性的纤维蛋白-琼脂糖生物材料可以高效仿生生成人类皮肤和角膜的生物工程替代物，这些替代物分别在严重皮肤烧伤和角膜溃疡患者中证明了临床效用。

在人类尿道领域，目前已描述了几种组织工程组织，但其中很少经过临床测试，包括一些基于胶原生物材料的无细胞组织替代物，以及通过组织工程生成的细胞性口腔黏膜替代物。大多数生物工程尿道替代物使用单一类型的细胞与不同生物材料结合。然而，已证明当多种细胞共培养时，可获得更有效的生物人工尿道模型。

尽管当前的生物制造方法允许高效生成单层生物人工组织，但尚未报道包含该器官所有三层的完全仿生的人类尿道替代物。在此背景下，塑性压缩纳米结构化技术的应用已证明能够生成硬腭的多层替代物。然而，该技术尚未应用于生成人类尿道多层替代物。

在本研究中，我们使用含有不同类型尿道细胞的纤维蛋白-琼脂糖生物材料生成了人类尿道各单独层（UM、SP和AL层）的替代物，并对各层进行了全面表征分析，以确定其与人类天然尿道的仿生程度。然后，我们使用纳米结构化方法制造了一种包含三层的新型全层人尿道替代物（FHUS）。

2 METHODS

2.1 组织样本、细胞培养和尿道替代物的生成

从Innoprot公司购买对应于不同组织的正常人原代细胞，包括膀胱基质成纤维细胞、尿路上皮细胞、平滑肌细胞或肌瘤细胞以及微血管细胞。细胞在37°C、5% CO₂的标准培养条件下培养，使用供应商为每种细胞类型指示的培养培养基和方案。细胞在亚汇合时使用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）混合物进行消化，并在新培养瓶中扩增。

为了生成人类尿道三个主要层（包括UM层、SP和白膜AL层）的生物工程替代物，将每种细胞类型与纤维蛋白（SP）或纤维蛋白-琼脂糖水凝胶（UM和AL）结合，遵循先前描述的生物制造方案。在所有情况下，首先制造细胞基质替代物，对于UM（在人类尿道中由复层上皮层和下方的基质层组成），随后在上方培养上皮层。简要来说，为生成500μL水凝胶，将380μL人血浆与62.5μL含有特定组织层细胞类型的培养培养基（UM为10⁵个培养的成纤维细胞，SP为10⁵个微血管细胞，AL为2×10⁵个肌瘤细胞）、7.5μL氨甲环酸和25μL 2%氯化钙混合。对于基于纤维蛋白-琼脂糖水凝胶的组织（UM和AL），在程序的最后一步向混合物中加入25μL 2% VII型琼脂糖溶液（溶于PBS中），而为生成SP替代物则加入25μL PBS。该混合物分装到带有多孔培养插入物的12孔培养板中，并在37°C细胞培养箱中凝胶化24小时。对于UM替代物，随后将7.5×10⁴个尿路上皮细胞传代培养在基质替代物上表面，并应用气-液培养技术诱导上皮分层和分化。在所有情况下，每种生物工程组织层使用其各自的培养培养基培养，并在37°C细胞培养箱中保持14天。

一旦通过组织工程生成人类尿道的三个主要层（UM、SP和AL），我们使用纳米结构化方法构建了包含这三层的FHUS。简而言之，将AL替代物小心放置在位于几层3MM滤纸上的无菌尼龙膜（孔径0.22μm）上。然后，将SP替代物放置在上方，随后是UM层（上皮层在上方），形成一种胶合板状结构。之后，使用尼龙手术网覆盖上皮，随后是第二层孔径0.22μm的尼龙膜和几层无菌3MM滤纸。然后，施加500g重量3分钟以诱导塑性压缩纳米结构化和三层融合，形成三层替代物，将其缝合在硅胶导师管周围，形成中空管状结构，能够再现人类天然尿道的三维形态，这被视为FHUS。本研究中生成了八个不同的管状FHUS构建体（n=8），并随后测量了它们的直径和厚度。

作为对照，从同意参与研究的男性捐赠者获取正常人尿道小片段。简而言之，获取附着在因泌尿系统疾病（良性前列腺或膀胱疾病）切除的泌尿器官上的尿道组织小块，并如下所述进行组织学分析处理。所有样本均非专门为研究而从患者身上切除，所有样本均对应于预定手术后丢弃的组织。

2.2 细胞活力

为了评估尿道替代物各层（UM、SP和AL）中包含的细胞在每个随访时间点（2、7和14天）的活力，我们使用Live/Dead（LD）细胞活力测定法，遵循制造商适用于三维结构的说明。为此，每个时间和实验组分析三个不同的样本（n=3）。对应于UM、SP和AL层的组织样本经过纳米结构化处理，并在含有0.05%钙黄绿素AM和0.2%乙锭同型二聚体-1的PBS溶液中孵育10分钟。然后，样品在PBS中洗涤，置于载玻片上，并小心盖上盖玻片。这形成了一层薄且光学可及的层，允许使用Eclipse i90荧光显微镜在绿色和红色荧光下进行全深度分析。对各组织类型和各时间点的整个构建体厚度进行细胞存活量化。为进行量化，每个样本随机选择并分析三个交替视野。使用FIJI软件v2.14.0/1.54f计算各组织类型和各随访时间的活细胞和死细胞百分比。

2.3 组织学、组织化学和免疫组织化学

将本研究在不同分析时间生成的各类生物人工组织样本以及对照正常人尿道在缓冲福尔马林中固定24小时，使用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，并遵循常规组织学分析方案包埋在石蜡中。然后获取2μm厚度的组织切片， mounted在载玻片上，脱蜡并复水。为进行一般结构分析，切片按照标准染色方法进行苏木精和伊红（HE）染色，并使用Pannoramic DESK II DW扫描仪获取图像。

为确定UM组织上皮细胞的增殖率，我们进行了针对细胞增殖标志物KI-67的间接免疫组织化学分析，并计算了每个实验组中显示该标志物阳性表达的增殖细胞百分比。为评估上皮分化，对UM组织进行了针对细胞角蛋白7和14（CK7和CK14）以及尿溶蛋白1b（UPK1b）的免疫组织化学分析，而通过免疫荧光评估了细胞间连接蛋白桥粒斑蛋白（DSP）、紧密连接蛋白1（TJP1）和claudin。间接免疫组织化学也用于评估UM、SP和AL中基底膜两种相关成分（胶原IV和层粘连蛋白）和细胞外基质（ECM）关键成分（多能蛋白聚糖，VCAN）的存在。使用血管分化标志物CD31和CD34在SP中揭示血管的存在，而使用α-平滑肌肌动蛋白（SMA-ACT）、smoothelin（SMOO）和desmin标志物标记肌瘤细胞。免疫组织化学程序的技术细节（抗体、预处理和参考文献）在支持信息表S1中汇总。

此外，使用天狼星红（PSR）组织化学染色ECM的纤维状胶原。为此，样品在F3B天狼星红试剂中孵育30分钟，随后用Harris苏木精复染5分钟。使用阿尔新蓝（AB）组织化学方法鉴定非纤维ECM蛋白聚糖，通过将组织切片在AB工作溶液中孵育30分钟并用核固红复染1分钟。在两种情况下，染色样品脱水并封片。

对于扫描电子显微镜分析（SEM），生物工程FHUS的切片在2.5%缓冲戊二醛中固定，在0.05M pH 7.2二甲胂酸盐缓冲液中洗涤三次，用浓度递增的丙酮脱水，使用临界点方法干燥，并溅射镀金-钯。样品安装在铝桩上，并在FEI Quanta 200环境扫描电子显微镜中检查。

对于这些组织学、组织化学和免疫组织化学分析，每种样本类型（UM、SP、AL和FHUS）分析八个不同的样本（n=8）。

2.4 生物力学分析

为确定本研究生成的不同组织替代物的生物力学特性，将对应于发育第14天的纳米结构化UM、SP、AL和FHUS进行拉伸测试，使用Instron 5943生物力学分析设备。每种情况下，将尺寸约为30×10 mm的矩形组织切片放置在分析机器上并固定到分析夹具，夹具之间自由距离为10 mm。测试通过在两个夹具之间施加恒定拉伸应力进行，恒定应变率为5 mm/min，直至样品断裂。使用50 N载荷传感器分析每个样品的生物力学行为。在每个样品中，使用Instron Blue Hill 2材料测试软件计算杨氏模量（对应于应力-应变曲线初始线性段的切线模量）、断裂应力（对应于样品发生断裂的应力-应变曲线上的点）和拉伸变形（计算为样品断裂前的总伸长率，以百分比表示）。作为对照，从当地屠宰场获取与生物工程样品尺寸相同的天然雄性猪尿道组织切片，清除所有脂肪组织或其他不同于天然尿道三个主要层（UM、SP和AL）的结构残留物，并如生物工程组织所述进行生物力学分析。基于研究组先前的研究，每种样本类型（UM、SP、AL和FHUS）分析八个不同的样本（n=8），表明该样本量允许以高置信度和可重复性进行统计比较。

2.5 定量和统计分析

首先，对UM、SP和AL中分析的基底膜标志物（胶原IV和层粘连蛋白）的免疫组织化学信号进行半定量评估。为此，三位专家组织学家分析每张图像，并将反应信号评分强（+++）、中（++）、弱（+）或阴性（-），使用先前报告的标度。

使用分割通道并对每个时间和尿道层的LD图像中的绿色和红色通道应用阈值来分析每个组织层中的细胞活力，而对KI-67阳性和阴性细胞进行计数以确定6张图像中每种条件下的细胞增殖谱（n=6）。

对于UM层中上皮标志物和每个细胞层中基质成分（包括ECM分子、血管和肌瘤细胞）的分析，我们使用ImageJ软件量化染色信号。简而言之，对应于组织化学方法PSR和AB以及UPK1b、CK7、CK14、DSP、TJP1、claudin、VCAN、CD31、CD34、SMA-ACT、SMOO和desmin免疫组织化学分析的图像在选择每种分析方法的特定颜色通道后转换为二进制（黑白），并在选择50×50μm正方形区域后由ImageJ程序自动量化阳性信号占据的组织百分比（面积分数）。每种样本类型获得八次测量（n=8）。

使用Real Statistics Resource Pack软件（Release 7.2）进行上皮标志物、基质成分（ECM分子、血管和肌瘤细胞）和生物力学特性结果的统计比较。首先，使用Shapiro-Wilk检验评估每个变量数据分布的正态性。由于大多数变量不符合正态分布，选择非参数检验进行进一步分析。具体来说，Mann-Whitney U检验用于两个特定组之间的成对比较。对于所有定量分析，每组使用样本量n=8。对于基质成分，我们在对照组（CTR）与每个随访时间点（第2、7和14天）的实验组之间进行了比较分析，并在两个特定时间点之间进行了比较以评估组织反应的时间变化。对于生物力学特性，在CTR与每种特定组织替代物类型（UM、SP、AL和FHUS）之间进行了统计比较，并在特定组织替代物类型之间进行了比较以评估不同构建体之间机械性能的差异。为控制多次比较导致的I类错误，应用了Bonferroni校正，并设定了Bonferroni调整后的p值0.001用于统计显著性，以增加观察结果的统计置信度。

3 RESULTS

3.1 组织工程生成的各生物工程尿道层（UM、SP和AL）的细胞活力和细胞增殖分析

当我们分析在培养中保持2、7和14天的每个单独组织层（UM、SP和AL）中细胞的活力时，我们发现大多数细胞保持存活，所有样本显示超过98%的活细胞。然后，我们通过KI-67表达确定的细胞增殖分析显示，增殖细胞百分比最高对应于体外保持2天的生物人工组织（D2样本）。增殖细胞百分比随培养时间趋于减少。有趣的是，最低增殖水平发现于CTR样本的SP和AL层，尽管CTR的上皮细胞显示出高增殖率。

3.2 组织工程生成的各生物工程尿道层（UM、SP和AL）及CTR天然尿道的组织学分析

使用HE染色对实验室生成的每个单独层（UM、SP和AL）以及用作对照的人天然尿道进行的组织学分析揭示了样本间的若干差异。首先，我们发现UM层由一个非常薄的上皮层（仅一层细胞）和一个含有规则生物材料的基质层组成，其中可见稀少细胞。当在随访第7天分析该结构时，我们发现了一个具有2到4层细胞的复层上皮，并且基质中的细胞比先前分析时间更丰富且更伸长。在第14天，我们发现一个更厚的上皮（多达10层细胞），并且基质密集分布着伸长和纺锤形细胞。与用作对照的天然尿道相比，UM的上皮层显示较低的分化水平，没有天然尿道上皮各层的精细结构和组织，尽管基质中的细胞数量与UM相当。关于SP层，我们发现该结构由一种规则、致密的材料组成，其中细胞分散，在本文分析的三个随访时间中细胞数量差异很小。然而，我们发现细胞在体外发育第7和14天倾向于组织成类似于微血管系统的中空结构。在CTR的情况下，这些微血管结构更丰富，并且围绕微血管的细胞数量比SP更高。最后，AL层的组织学分析揭示了从第2天到第14天存在丰富的伸长细胞，与第2天相比，第7和14天细胞数量有增加趋势。该结构部分类似于CTR组织，尽管天然尿道包含更多细胞，并且这些细胞倾向于组织成具有丰富细胞质的束状结构，这与存在良好组织的肌肉组织相容，而这在生物工程组织中缺失。

3.3 组织工程生成的尿道黏膜层及CTR组织的组织化学、免疫组织化学和免疫荧光分析

使用组织化学、免疫组织化学和免疫荧光方法对人UM相关标志物的分析显示，人天然尿道（CTR样本）的上皮对所有分析的上皮标志物均呈强阳性，包括UPK1b、CK7、CK14、DSP、TJP1和claudin。相比之下，生物人工UM组织在发育第2天最初显示所有这些标志物的表达非常低或阴性，与CTR相比有显著差异，并在第7和14天趋于增加，尽管未达到CTR样本中发现的高阳性水平，并且对于所有标志物，在第7和14天与CTR的差异均具有统计学意义。有趣的是，对应于第7和14天的样本非常相似，仅发现CK14存在统计学显著差异。

然后，我们分析了UM中基底膜的两个关键成分，发现培养2天的生物人工UM组织对胶原IV和层粘连蛋白呈阴性，而CTR对两种标志物均呈强阳性。生物工程UM样本在第7和14天对胶原IV呈中等阳性，对层粘连蛋白呈弱阳性。

另一方面，对UM基质层中ECM成分的评估显示，CTR样本对PSR、AB和多能蛋白聚糖呈强阳性信号，所有样本间存在统计学显著差异。对于PSR，我们发现对应于发育第2和7天的人工UM样本显示低水平PSR信号，在第14天显著增加，尽管这些组织显著低于CTR组织。对于AB，所有生物工程UM组织均显著低于CTR，第2、7和14天的样本间无差异。对于多能蛋白聚糖，最低水平对应于第2天样本，在第7天显著增加，并在第14天显著增加，尽管所有生物人工样本均显著低于CTR。

3.4 组织工程生成的海绵体层及CTR组织的组织化学和免疫组织化学分析

在SP层的情况下，我们首先发现CTR组织对基底膜成分胶原IV和层粘连蛋白呈强阳性，其表达限于该水平丰富血管周围的区域。在发育第2天，生物工程SP样本在分散于整个生物材料的细胞中呈中等阳性。然后，第7和14天的样本在血管周围显示强胶原IV信号，与CTR样本情况相同，而这些生物工程组织在第7和14天对层粘连蛋白保持中等阳性，水平低于CTR。

此外，我们使用PSR和AB组织化学以及多能蛋白聚糖免疫组织化学对组织ECM关键成分的分析显示，在培养2、7和14天的生物人工SP组织中信号非常低，而在CTR组织中信号非常高，天然与人工组织之间的差异具有统计学意义。最后，我们使用CD31和CD34免疫组织化学评估了血管的存在。对于ECM成分，我们发现对应于2、7和14天随访的生物工程SP组织间无显著差异，而与CTR组织的差异显著。

3.5 组织工程生成的白膜层及CTR组织的组织化学和免疫组织化学分析

对天然尿道（CTR样本）AL层中基底膜关键成分的分析显示，局限于该层分配的肌肉细胞区域呈强阳性信号。对于胶原IV，我们发现生物人工AL在第2天呈阴性，在第7天呈弱阳性，并在随访第14天呈强阳性。对于层粘连蛋白，我们的结果显示生物人工AL在第2和第7天呈阴性信号，并在发育第14天呈中等阳性信号。

当在天然CTR组织的AL层中分析ECM成分时，我们发现最强的组织化学和免疫组织化学信号对应于CTR，其包含的胶原纤维、蛋白聚糖和多能蛋白聚糖（分别通过PSR、AB和多能蛋白聚糖免疫组织化学测定）显著高于生物工程AL。对于PSR和AB，生物工程组织显示低染色信号，培养时间之间无显著差异。然而，多能蛋白聚糖免疫组织化学显示从第2天到第7天显著增加，尽管第7天和第14天样本无统计学差异。

此外，对三种与平滑肌细胞分化相关蛋白质的免疫组织化学分析显示，天然CTR组织表达的SMA-ACT、SMOO和desmin水平显著高于生物工程AL。对于SMA-ACT和SMOO，对应于不同随访时间的生物工程组织显示无显著差异。然而，我们发现生物工程AL中desmin表达随时间增加的趋势，该免疫组织化学标志物在第2天和第14天样本间存在统计学显著差异。

3.6 通过组织工程生成全层替代物

一旦各个层被表征，我们将对应于发育14天的UM、SP和AL组合成单一结构以生成FHUS。该FHUS的宏观分析显示出一个具有内腔的伸长管状结构，直径为1.96±0.89 mm，厚度为116.50±7.41 μm。当使用HE染色对该结构进行组织学分析时，我们发现FHUS由单一结构组成，其中可以检测到几层含有不同类型细胞的致密材料。在FHUS顶部发现表层上皮，其覆盖着含有伸长细胞的致密材料（对应于UM）。在该黏膜下方，我们发现两层含有细胞的纤维材料，最顶层的（对应于SP）显示材料纤维间丰富的空间，最深层（对应于AL）显示密集堆积的生物材料纤维。

3.7 生物工程组织和对照猪尿道的生物力学特性分析

对本研究生成的不同组织替代物（UM、SP、AL和FHUS）以及对照猪尿道的生物力学行为分析显示，总体上所有样本更弹性而非刚性，因为拉伸变形高于杨氏模量。首先，我们发现杨氏模量在UM、SP和AL样本中较低，并且FHUS的生成导致该参数与UM和AL相比显著增加。然而，没有任何生物工程组织达到天然尿道的水平，其杨氏模量高于其余样本。对于断裂应力发现类似行为，与UM、SP和AL样本相比，FHUS显著增加，尽管水平显著低于天然组织。然而，拉伸变形分析显示样本间无显著差异，所有组织类型显示高程度的拉伸变形（大多数情况下高于100%）。

4 DISCUSSION

几种人类尿道的生物人工替代物模型已通过组织工程生成。然而，这些替代物大多数是无细胞的或仅包含一种类型的细胞，并且尚未报道包含该器官三个主要层的全层尿道替代物。在这方面，有人提出通过组织工程产生的组织应能够仿生再现多层器官的复杂结构，这显著提高了这些结构的实用性。

不同的生物制造方法已被描述用于开发多层组织，包括3D生物打印、与不同类型膜的组合或添加性生物制造方法等。此外，我们先前描述了一种生物制造方法，允许将生物工程组织的多个层组合并融合成单一结构，该方法应用于生成兔硬腭的全层替代物。该方法基于先前应用的塑性压缩纳米结构化方案，以改善用于人类角膜、皮肤、神经和其他结构组织工程的生物材料的生物力学性能。与这些先前的报告一致，我们证明纳米结构化在人类尿道组织工程中的应用可以有效地用于生成包含该器官三个主要层的FHUS。

在本研究中，我们首先生成了人类尿道各层的生物工程替代物，包括UM、SP和AL层，并且发现细胞在用于生成每个组织层的纤维蛋白或纤维蛋白-琼脂糖生物材料中具有高活力。这些结果与我们研究组先前的报告一致，表明这些生物材料具有高生物相容性，并且在这些材料中培养的细胞保持高水平的细胞活力，这可以解释当纤维蛋白-琼脂糖生物人工组织移植给患者时获得的良好结果。此外，细胞增殖分析显示，实验室生成的生物人工组织在发育的最初几天倾向于积极增殖，但随着组织获得更高的分化特征而趋于减少增殖。这种现象并不令人惊讶，因为已证明增殖和分化可能是相反的过程，倾向于以相反的方式表现。

对实验室生成的生物工程组织进行彻底的临床前验证和表征是未来临床转化的关键要求。因此，在将它们用于生成FHUS之前，对每个生物工程层（UM、SP和AL）进行了表征以确定这些结构的主要组织学、组织化学和免疫组织化学特征。当评估和表征生物工程UM时，我们发现该结构在存在复层上皮和下方基质层方面部分仿生天然UM。当分析生物工程UM的上皮层时，我们发现该结构倾向于在培养中随时间演变，上皮层从第2天到第7天逐渐分层，尽管细胞未能达到天然上皮中发现的分化水平，正如先前对培养中保持的其他生物工程组织所建议的那样。上皮层的适当分化和组织是人工组织的重要要求，因为已证明该上皮的生物学功能严格依赖于细胞组织和分化。在这方面，我们对生物人工UM上皮层相关上皮细胞标志物的分析显示，所有分析标志物的表达逐渐增加，包括几种细胞角蛋白、细胞-细胞连接以及尿路上皮细胞的特定标志物UPK1b。尽管在随访时间内未达到CTR组织中发现的高表达水平，但我们的结果表明生物人工UM部分分化并与CTR组织共享重要的分子相似性，尽管在分析