靶向内皮细胞的工程化细菌胞外囊泡负载二氢丹参酮I用于动脉粥样硬化治疗

　　本研究发现，利用工程化内皮细胞靶向性益生菌胞外囊泡（EC-BEVs）负载二氢丹参酮I（DHT）的新型纳米递送系统（EC-BEVsDHT），通过特异性靶向动脉粥样硬化（AS）病灶，显著改善DHT的生物利用度和靶向性，在体外有效减轻氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤，在ApoE?/?小鼠模型中显著降低动脉粥样硬化斑块形成和脂质积累，为心血管疾病治疗提供了安全有效的靶向纳米治疗新策略。

　　

研究背景与意义

动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）是一种复杂的心血管疾病，以内皮功能障碍、血脂异常和免疫炎症反应为特征，导致动脉斑块形成和心肌梗死、卒中等致命并发症。传统他汀类药物治疗存在副作用和疗效有限的问题。二氢丹参酮I（Dihydrotanshinone I, DHT）作为丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化和抑制间质钙化等多重药理作用，但其小分子量、短半衰期和低水溶性限制了其生物利用度和靶向性。

细菌胞外囊泡（Bacterial Extracellular Vesicles, BEVs）是细菌分泌的纳米级脂质双层结构，具有细胞自由系统、稳定载药能力、良好生物相容性和易修饰等优势。本研究利用益生菌Lactobacillus rhamnosus GG（LGG）生产的BEVs，通过合成生物学方法构建内皮细胞（Endothelial Cells, ECs）靶向的工程化BEVs，并负载DHT，形成EC-BEVs^DHT纳米递送系统，旨在提高DHT的靶向性和治疗效果，为动脉粥样硬化治疗提供新策略。

材料与方法

工程化BEVs的构建与表征

通过合成生物学方法，将人源内皮细胞靶向肽VSSSTPR的编码序列优化并插入pClyA质粒，转化至LGG中，构建重组菌株LGG-pClyA-hVec-ECs。通过超速离心和超滤技术分离EC-BEVs，并采用电穿孔法将DHT负载至BEVs中，形成EC-BEVs^DHT。透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope, TEM）和纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）显示BEVs呈典型球形形态，粒径分布均匀（约143-146 nm），浓度达1.26-1.51×10¹¹ particles/mL。高效液相色谱-串联质谱（High-Performance Liquid Chromatography coupled with Tandem Mass Spectrometric, HPLC-MS/MS）证实EC-BEVs^DHT中靶向肽VSSSTPR的成功表达，DHT负载量为9.694±1.473 μg/50 μg BEVs蛋白。

体外细胞实验

以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为模型，通过PKH67荧光标记评估BEVs的细胞摄取效率，发现EC-BEVs和EC-BEVs^DHT对HUVECs具有更高亲和力。采用ox-LDL（100 μg/mL）诱导HUVECs损伤，模拟动脉粥样硬化微环境。CCK-8实验显示，EC-BEVs^DHT显著逆转ox-LDL诱导的细胞活力下降。流式细胞术检测细胞凋亡，发现EC-BEVs^DHT处理显著降低ox-LDL诱导的HUVECs凋亡率。Transwell实验表明，EC-BEVs^DHT抑制ox-LDL增强的HUVECs迁移能力。

体内动物实验

采用ApoE^?/?小鼠模型，通过高脂饮食诱导动脉粥样硬化。尾静脉注射PKH67标记的EC-BEVs^DHT（2 mg/kg），4小时后组织荧光检测显示动脉中特异性富集。长期毒性实验表明，EC-BEVs^DHT对心、肝、肾、肺和脑无显著病理损伤，肝功能指标ALT（丙氨酸转氨酶）、AST（天冬氨酸转氨酶）和肾功能指标BUN（血尿素氮）无显著变化，证明其良好生物安全性。

组织学与生化分析

油红O染色显示，EC-BEVs^DHT处理显著减少ApoE^?/?小鼠主动脉脂质积累和动脉粥样硬化斑块。HE染色进一步证实EC-BEVs^DHT降低主动脉弓和主动脉病变面积。Masson三色染色显示胶原含量减少，提示斑块稳定性增强。血清脂质谱分析表明，EC-BEVs^DHT显著降低甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），提高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。肝功能指标ALT和AST在EC-BEVs^DHT处理组显著降低，提示肝保护作用。

转录组学分析

RNA测序（RNA-seq）分析HUVECs和ApoE^?/?小鼠主动脉组织基因表达谱。在HUVECs中，EC-BEVs^DHT处理导致2648个差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析显示，DEGs主要涉及年轻成熟糖尿病（Maturity onset diabetes of the young）、补体和凝血级联（Complement and coagulation cascades）及IL-17信号通路。在ApoE^?/?小鼠主动脉组织中，EC-BEVs^DHT处理导致692个DEGs，富集于糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy）、柠檬酸循环（Citrate cycle）和产热（Thermogenesis）等通路。这些结果表明EC-BEVs^DHT通过调节炎症、代谢和信号通路发挥抗动脉粥样硬化作用。

讨论

本研究成功构建了内皮细胞靶向的工程化BEVs负载DHT的纳米递送系统（EC-BEVs^DHT），通过特异性靶向动脉粥样硬化病灶，显著提高DHT的生物利用度和治疗效果。体外实验证实EC-BEVs^DHT有效减轻ox-LDL诱导的HUVECs损伤，抑制细胞凋亡和迁移。体内实验显示EC-BEVs^DHT在ApoE^?/?小鼠模型中显著降低动脉粥样硬化斑块形成和脂质积累，改善血脂谱和肝功能，且无显著毒性。转录组学分析揭示其作用机制涉及炎症反应、代谢调节和信号通路调控。

与传统他汀类药物相比，EC-BEVs^DHT具有靶向性强、副作用小和疗效高等优势，为动脉粥样硬化治疗提供了新型纳米治疗策略。未来研究可进一步优化BEVs的载药效率和靶向性，探索其临床转化潜力。

结论

EC-BEVs^DHT作为一种安全有效的靶向纳米治疗系统，通过提高DHT的生物利用度和靶向性，显著抑制动脉粥样硬化进展，具有重要的临床转化价值。该研究为心血管疾病治疗提供了新思路，有望成为传统治疗的有效替代方案。