用于细胞内铜催化叠氮-炔环加成反应筛选的示踪纳米催化剂：双功能设计与生物正交催化应用

　　本文报道了一种新型双功能示踪纳米催化剂Cu@BTTAA-Cy5-NPs的开发与应用，该催化剂将异相CuAAC催化活性与内在荧光示踪功能整合于单一纳米颗粒平台。通过系统性表征证实其优异单分散性、高铜负载量（20 ppm）和Cu(I)/Cu(II)共存状态，在体外催化多种叠氮-炔底物环加成反应中展现高效率（15分钟完成转化）和良好循环使用性（7次循环保持95%产率）。特别值得关注的是，该纳米催化剂在活细胞（MDA-MB-231）内成功实现荧光示踪指导的原位反应优化，并首次演示了细胞内抗癌前体药物的原位合成与激活，为生物正交化学在精准医学中的应用提供了创新性工具。

　　

1 引言

铜催化叠氮-炔环加成反应（CuAAC）作为点击化学的代表性反应，因其高效率和模块化特性被广泛应用于化学生物学领域。尽管其生物正交性在活体系统中展现出巨大潜力，但铜毒性问题及细胞内复杂环境中催化活性的控制仍是重大挑战。异相铜催化剂通过最小化游离铜暴露和实现局部活性可降低毒性，但在活细胞内优化其性能仍存在显著障碍。本研究基于前期开发的金属荧光交联聚苯乙烯纳米颗粒平台，设计了一种集成了稳健异相CuAAC催化活性和内在荧光示踪功能的新型双功能纳米催化剂Cu@BTTAA-Cy5-NPs。

2 结果与讨论

2.1 荧光铜纳米催化剂的合成、功能化与表征

通过分散聚合法获得单分散交联聚苯乙烯纳米颗粒，采用标准Fmoc固相协议进行双功能化。首先将芴甲氧羰基保护的聚乙二醇（Fmoc-PEG） spacer与氨基功能化的纳米颗粒连接，随后连接正交保护的赖氨酸，利用其α和ε氨基分别共价偶联BTTAA配体和Cy5荧光染料。BTTAA（2-(4-((双((1-(叔丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙酸酸）被选为强效铜(I)稳定配体，其羧酸基团可实现与纳米颗粒表面胺基的共价耦合。磺基-Cy5作为荧光标记用于纳米颗粒示踪。最终通过CuBr在DMF中进行金属配位，经离心纯化获得最终产物Cu@BTTAA-Cy5-NPs。

理化表征显示：动态光散射（DLS）证实纳米颗粒单分散性，流体动力学尺寸约480 nm；zeta电位测量显示所有功能化纳米颗粒均保持稳定正表面电荷；透射电镜（TEM）和高分辨TEM（HRTEM）图像确认球形形态；X射线光电子能谱（XPS）分析揭示纳米颗粒内同时存在Cu(I)（结合能≈932.5 eV）和Cu(II)物种（结合能≈934.5 eV）；电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）定量显示Cu@BTTAA-Cy5-NPs的铜负载量（20 ppm）比Cu@BTTAA-NPs（2.58 ppm）高约10倍，表明磺基-Cy5 moiety可能通过其磺酸基团与π电子系统对铜配位有显著贡献；流式细胞术分析确认Cu@BTTAA-Cy5-NPs保留了荧光特性，可在APC-A通道清晰检测。

2.2 铜纳米催化剂作为催化剂的条件优化

以4-叠氮茴香醚（A-3）与苯乙炔（Phe）生成14c的模型反应评估催化剂性能。系统筛选表明：Cu@BTTAA-NPs在0.1 ppm铜浓度下48小时无反应；0.5 ppm时48小时实现100%转化；2 ppm时1小时即可完成转化。无抗坏血酸钠时反应不发生，证实其维持催化活性Cu(I)状态的重要性。在相同条件（2 ppm Cu，抗坏血酸盐）下，Cu@BTTAA-Cy5-NPs仅需15分钟即实现完全转化，显著快于Cu@BTTAA-NPs（1小时），这主要归因于其更高的铜负载能力。

有趣的是，在甲醇-水混合物中省略抗坏血酸时，反应仍能进行（24小时约80%转化，36小时完全转化），表明NP 11的特定配位环境可能提供某种内在Cu(I)稳定化或促进催化周转。在纯水溶剂中反应效率低（24小时<10%转化），但添加0.5% DMSO后2小时即可完全转化。在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中3小时实现完全转化，证明了在生物相关环境中的潜在适用性。

催化剂可回收性测试显示：经过7次循环后仍保持95%以上产率；从第7周期开始完全转化所需时间增加。UV-vis光谱分析证实甲醇-水混合物中铜浸出可忽略；催化剂过滤（热过滤）测试表明移除固体催化剂后无进一步产物形成，证实异相催化过程。

2.3 Cu@BTTAA-Cy5-NPs (11)的适用范围

在最佳条件下（甲醇:水=1:1，室温，铜催化剂0.314 mol%，钠抗坏血酸盐0.1 eq）测试广泛底物范围。带有给电子或吸电子基团的叠氮化物与各种取代末端炔烃的点击反应均能以高收率和短反应时间获得预期产物（15分钟至30分钟，收率95%-99%）。值得注意的是，含游离氨基的底物（如4-氨基叠氮苯或炔丙胺）也能成功生成相应环加合物，表明催化剂对挑战性官能团的耐受性。

成功应用点击化学合成荧光分子：反应物3-叠氮-7-羟基香豆素和苯乙炔无荧光，而最终产物14k（7-羟基-3-(4-苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)-香豆素）（λexc: 355 nm和λem: 449 nm）具有荧光特性，可通过测定449 nm处荧光强度监测反应动力学。动力学分析表明反应遵循一级动力学。此外，成功合成含三唑的治疗性化合物14l（白藜芦醇衍生物），其具有抗癌潜力和多种有益特性，为开发细胞基生物正交铜辅助前药提供了可能性。

2.4 纳米催化剂的细胞摄取效率与安全性评估

使用难以靶向的三阴性乳腺癌细胞系（MDA-MB-231）评估细胞摄取。通过APC通道荧光强度定量显示：细胞摄取随纳米催化剂浓度（0.02–69.5 fmol Cu/细胞）和时间（0–24小时）增加而显著增加。

安全性评估遵循纳米技术表征实验室（NCL）推荐方案：无菌性测试显示无菌落形成；内毒素水平低于0.25 EU/mL；MTT assay显示在高达23.2 fmol浓度下细胞活力≈100%；细胞凋亡和活性氧（ROS）测定表明，与铜溶液加抗坏血酸盐不同，Cu@BTTAA-Cy5-NPs处理不诱导晚期凋亡或ROS水平增加；溶血试验显示所有测试NPs的溶血活性低于1%，符合ASTM E2524-08标准（显著溶血>5%）。综合表明开发的Cu@BTTAA-Cy5-NPs在催化相关浓度下具有高生物相容性。

2.5 细胞内的点击反应

利用纳米催化剂的双功能特性（催化剂和荧光示踪剂），通过流式细胞术定量Cu@BTTAA-Cy5-NPs对细胞内CuAAC的原位催化性能。荧光三唑产物14k在Pacific blue通道（激发/发射410/495 nm）发射，与Cy5标记的纳米催化剂（APC-A通道，激发/发射650/670 nm）分开，允许同时监测催化反应和纳米颗粒分布。

通过系统筛选细胞内反应条件（纳米催化剂量、反应时间、炔烃、叠氮化物和抗坏血酸盐浓度）发现：23.2 fmol铜与500 μm钠抗坏血酸盐，底物浓度0.2–40 mm苯乙炔和40 μm 3-叠氮-7-羟基香豆素（A-5）能够在3小时内实现稳健高效的细胞内CuAAC反应，95%以上细胞显示高荧光。

共聚焦显微镜显示：荧光香豆素衍生物14k仅在用Cu@Cy5-BTTAA NPs孵育的细胞中形成，细胞质荧光增加；而对照细胞（无纳米催化剂）在Pacific Blue通道无信号。流式细胞术进一步证实：随着Cu@BTTAA-Cy5-NPs浓度增加，荧光香豆素衍生物14k浓度依赖性增加，最高可达100%荧光细胞。HPLC-MS分析细胞裂解液证实了化合物14k的形成。

随后演示了纳米催化剂在细胞内原位合成抗癌药物的能力：选择白藜芦醇衍生物14l（5-(4-苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯-1,3-二醇）因其抗癌潜力。细胞毒性评估显示化合物14l显著降低MDA-MB-231细胞活力（IC50 = 58.92 μm）。将细胞与Cu@BTTAA-Cy5-NPs预孵育后加入前体13和苯乙炔，在钠抗坏血酸盐存在下，显示细胞活力显著降低，而无铜对照无毒性。HPLC-MS分析证实了化合物14l的细胞内形成。

3 结论

成功开发了一种新型双功能荧光铜负载纳米催化剂Cu@BTTAA-Cy5-NPs，专为活细胞内受控催化活性设计。该系统的核心成就在于成功将其转化为细胞内环境，特别利用其独特双功能特性：通过固有荧光示踪催化剂定位，并通过单独荧光通道定量荧光三唑产物形成，能够使用荧光反馈进行全面原位筛选和优化细胞内CuAAC反应条件。这种在活细胞内监测催化剂存在并直接与反应结果相关联的能力代表了显著进步，为在复杂生物环境中理解和控制生物正交化学提供了强大工具。

进一步通过原位合成细胞毒性三唑衍生物证明了该平台的实用价值，突出了可示踪纳米催化剂在时空控制前药激活方面的潜力，实现特异性在催化剂存在和活跃位置提供治疗效果。

Cu@BTTAA-Cy5-NPs作为一种可示踪纳米催化剂，能够在活细胞内实现铜催化反应的原位研究和优化，为细胞内生物正交化学领域的发展提供了宝贵工具。当前设计依赖于非特异性细胞摄取，未来通过引入靶向配体（如抗体或适体）可实现细胞特异性递送，并将系统从体外细胞培养转化为复杂体内模型，评估纳米催化剂的生物分布和生理环境中的功效，最终推进其靶向治疗应用的潜力。