综述：用于免疫治疗靶点发现的微流控单细胞技术：从设计概念到临床前应用

　　本综述系统阐述了微流控技术在单细胞多组学分析中的前沿进展，重点介绍了数字微流控（DMF）、流体控制装置（HFCD）、微孔系统及液滴平台四大技术原理，及其在癌症免疫治疗和自身免疫病靶点发现中的转化应用，为精准免疫治疗提供了关键技术支撑。

　　

1 引言

免疫治疗通过调节患者免疫系统治疗疾病，已在癌症领域取得革命性突破，并逐渐拓展至自身免疫疾病领域。然而，免疫系统、肿瘤微环境（TME）及炎症组织中的细胞异质性严重制约了治疗效果。传统批量检测技术（如全外显子测序、Western blot）只能获得群体平均信号，无法揭示细胞间差异。单细胞分析技术可在转录组和蛋白组层面解析细胞异质性，而微流控技术凭借其微型化、并行化和集成化优势，成为实现高通量单细胞分析的关键工具。

微流控技术可操纵微尺度流体，通过减少试剂消耗、简化工作流程和提高一致性，显著提升单细胞捕获通量和分析灵敏度。该技术已推动单细胞基因组学、转录组学、蛋白组学及多组学分析的快速发展，加速了免疫治疗新靶点的发现。本综述详细讨论了用于单细胞分析的微流控平台设计原理、功能及局限性，并展望其未来在免疫治疗靶点发现 pipeline 中的整合与转化前景。

2 用于多组学分析的微流控系统原理与设计

2.1 数字微流控（DMF）

DMF 基于介质上电润湿（EWOD）原理，通过电极阵列控制液滴移动，实现单细胞分离、试剂混合、酶反应及清洗等操作（图2A）。其优势在于液滴操控精准、流程可编程且试剂消耗极低，但通量受限且 fabrication 复杂（需4-11层微加工）。DMF 适用于低输入样本的复杂操作，如单细胞全基因组测序（Digital-WGS），可将扩增偏差降至 CV=0.15，覆盖率提升至88.7%，成本降至1美元/15样本（图2B）。在转录组学中，DMF 平台（digital-RNA-seq）可从10个单细胞中检测超过50%的RNA效率。在蛋白检测方面，DMF 可实现微型化免疫细胞化学（DISC），灵敏度提升100倍，检测时间缩短至1小时（图2C）。但 DMF 面临生物污染和蛋白吸附问题，需通过表面涂层或兼容性去污剂解决。

2.2 流体控制装置（HFCD）

HFCD 集成微结构、流体通道和阀门系统，通过微阀隔离反应室实现精准单细胞操作（图3A,B）。其优势在于转录本/蛋白捕获效率高，兼容多步反应，但依赖外部压力系统，成本较高。商业化的 Fluidigm C1 系统可实现单细胞裂解、反转录和扩增，基因检测灵敏度高（图3C）。单细胞蛋白组学应用如 SciProChip 可检测1500个蛋白组，而 PeptiCHIP 将 HLA-I 复合物使用量降低100倍，灵敏度提升10倍（图3D）。HFCD 在转录组和蛋白组分析中灵敏度最高，但通量中等（通常并行处理数十个细胞），且 fabrication 复杂。

2.3 微孔系统

微孔系统由开放微/纳米孔阵列组成，通过重力或离心力实现单细胞沉降，操作简单、通量高且成本低（图4A）。例如，CytoSeq 系统含10万个微孔，可同时分析数千个细胞，但存在双联体和交叉污染风险。通过油相密封或半透膜封闭（如 Seq-well）可将RNA捕获效率提升至77.5%，纯度达98.4%。在蛋白分析中，微孔阵列可用于细胞分泌监测（如 IFN-γ 检测灵敏度达0.16 ng/mL）和单细胞质谱（nanoPOTS 从10个细胞中检测3092种蛋白）（图4C,D）。微孔系统适合高通量筛查，但需优化 bead-cell 配对并控制流体交换。

2.4 液滴微流控

液滴平台通过水包油乳液包裹单细胞和试剂，形成皮升级微反应器，通量极高（每小时生成数千万液滴）（图5A）。主流平台包括 InDrop、10× Genomics Chromium 和 Drop-Seq，其中10×灵敏度最高（检测1.7万条转录本）。液滴系统支持多组学分析，如 CITE-seq 和 REAP-seq 可同时检测蛋白和转录组（REAP-seq 复用82种蛋白）。在蛋白分泌监测方面，DropMap 可实时检测抗体分泌（灵敏度0.2 nM），但液滴操控难度大，且RNA捕获效率较低。未来需集成控模块提升液滴质量。

3 微流控多组学在靶点发现中的应用

3.1 癌症免疫治疗

微流控单细胞技术助力癌症诊断标志物（如 PD-L1、CTLA-4）筛选和新信号分子发现。HFCD（如 Fluidigm C1）可分析肺癌细胞系异质性，鉴定 CXCL2 等进展相关基因；亦可追踪肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），发现 ZNF683 等 T 细胞持久性靶点。微孔系统（如 SCOPE-Chip）剖析胶质母细胞瘤微环境，鉴定促肿瘤亚群 TAM-1；而 HL-Chip 可实时监测 T 细胞杀伤和细胞因子分泌。液滴平台（如10×）广泛用于 TME 免疫细胞图谱绘制，推动新抗原和 TCR 发现。

3.2 自身免疫病

微流控技术解析自身免疫病（如 SLE、MG）的免疫细胞异质性和致病机制。DMF 集成液滴排序可实现高通量自身抗体筛查；液滴 scRNA-seq 揭示 SLE 患者单核细胞中干扰素刺激基因（如 IFNAR1/2）上调，MG 患者中 CD180^? B 细胞与疾病活动相关。多疾病比较研究（如 CD4⁺ T 细胞跨病分析）发现12个独立基因程序调控异质性。这些研究为自身抗原和免疫调节靶点发现提供基础。

4 展望

微流控单细胞分析技术已逐步工业化（如 Bruker Cellular Analysis），并加速靶点发现（如新冠抗体 Bamlanivimab 研发周期缩短5倍）。未来需发展空间多组学整合技术以解析 TME 空间互作，开发活细胞动态分析平台结合终点检测，并降低成本提升可及性。微流控与人工智能、成像流式细胞术融合将推动智能分选和功能筛选，最终实现免疫治疗的精准化和个性化。