基于抗菌肽的血清稳定靶向递送平台：选择性治疗难靶向与耐药性肿瘤的新策略

　　本文推荐一篇创新性研究，该研究针对抗体药物偶联物（ADC）依赖内化抗原、靶点受限及耐药性等问题，开发了一种模块化抗菌肽（AMP）治疗系统。通过膜亲和力重构、构象驱动聚乙二醇化（PEGylation）阻断剂及N端封端（N-cap）策略，显著提升选择性、血清稳定性及安全性，为难靶向和化疗耐药肿瘤提供了新型精准治疗平台。

　　

模型AMP选择与初步生物学评价

研究选取Temporin-HLa（化合物111）作为模型抗菌肽（AMP），因其具备典型AMP特性，包括广谱抗增殖活性和显著膜破坏能力，但对正常细胞和红细胞也显示较强毒性，选择性差且治疗窗（TW）窄。血清存在下其IC₅₀值最高增加2.7倍，表明稳定性不足。

通过“膜亲和力重构”策略提升选择性

策略开发与化合物设计

研究提出“膜亲和力重构”策略，旨在通过受体-配体相互作用赋予AMP特异性膜结合亲和力。首先，通过替换Leu?、Gly?和Ala?为Lys?、Asp?和Asp?，得到化合物266，降低净正电荷和疏水性，从而减少对所有细胞的膜亲和力和破坏能力。随后，基于胡椒碱（piperine）作为多药耐药相关蛋白1（MRP1）和P-糖蛋白（Pgp）抑制剂的特性，设计并合成了包含Glu(PIP)¹⁰的化合物174-3，以靶向H460细胞系高表达的MRP1/Pgp。

化合物174-3展示增强的选择性细胞毒性

在七种肿瘤和正常细胞系中评估，化合物266无溶血或抗增殖活性，而174-3恢复细胞毒性，对H460（IC₅₀: 23.65 μM）和H838（IC₅₀: 39.54 μM）效果最强，对其他细胞系和红细胞作用较弱（IC₅₀或HC₁₀: 50–100 μM），显示活性与受体表达水平正相关。化合物111则无选择性。

膜破坏是化合物174-3抗肿瘤活性的基础

Annexin V/7-AAD和caspase-3/7染色表明，174-3诱导非凋亡性死亡，主要为膜破坏导致的坏死。DiSC₃(5)、SYTOX Green和LDH实验证实，174-3引起快速膜去极化、完整性破坏和LDH释放，与凋亡对照药依托泊苷（etoposide）作用机制不同。

特异性配体驱动化合物174-3的选择性膜亲和力与破坏能力

FITC标记类似物的结合实验显示，174-3对H460和H838细胞有浓度依赖性结合，而对低表达细胞系结合弱。竞争抑制实验表明，MRP1/Pgp抑制剂胡椒碱和MRP1特异性抑制剂丙磺舒（probenecid）可减少174-3结合，证实受体介导机制。LDH释放实验进一步验证其选择性膜破坏能力。将Glu(PIP)¹⁰替换为Phe¹⁰的化合物228失去选择性，证明配体的关键作用。此外，174-3未诱导RAW264.7巨噬细胞TNF-α分泌，表明无急性促炎反应。

构象驱动聚乙二醇化（PEGylated）阻断剂进一步减少副作用

为减少174-3对HEK-293细胞和红细胞的脱靶效应，研究将聚乙二醇（PEG）通过基质金属蛋白酶（MMP）可切割 linker GPLGLAG连接到C端，得到 conjugate 209。但实验发现linker未被酶切，而是通过构象变化发挥作用：在膜环境中形成α-螺旋，刚性化PEG并恢复膜破坏功能；在非靶环境中保持柔性，发挥屏蔽作用。Conjugate 209对H460保持活性（IC₅₀: 53.37 μM），而对HEK-293细胞IC₅₀升至98.6 μM，HC₁₀ >100 μM，选择性显著提升。对比柔性linker GGGGGGG的conjugate 288，209在SDS中α-螺旋含量更高，膜破坏能力更强。

N端封端（N-cap）策略改善血清稳定性

策略开发

174-3和209在血清中稳定性差，主要因氨基肽酶（aminopeptidase）介导的N端降解和血清蛋白结合。基于锌依赖氨基肽酶的水解机制，研究设计“N端封端”策略，引入带有孤电子对的二肽，干扰锌配位并减少蛋白结合。

从计算机筛选到实验验证：Ala-Lys作为最佳N-cap

分子对接筛选出AEF、ATF、ARF和AKF四类N-cap，最终合成化合物239-1至239-4。荧光猝灭实验表明，174-3与人血清 albumin（HSA）形成静态复合物，而N-cap类似物结合 negligible。血清稳定性实验显示，239-2（AT）和239-3（AR）主要丢失ATF三肽或AR二肽，239-4（AK）降解慢且IC₅₀ fold-change最低（≤3 after 24 h）。毒性评估中，239-4在保持抗肿瘤效能（IC₅₀: 22.22 μM）的同时，毒性增加最小。乙酰化Lys²的对照物239-4-Ac降解加快，证实Lys侧链的关键作用。

conjugate 270的治疗特性与机制评价

将AK N-cap整合到conjugate 209的N端，得到conjugate 247，但对HEK-293仍有毒性。增加PEG₄数量至6，获得最终化合物270。270对H460的IC₅₀为53.63 μM，IC₉₅ ≈55 μM，对正常细胞和红细胞无抑制，对HEK-293的抑制仅在≥95 μM时发生，绝对治疗窗（ATW）达40 μM。LDH实验显示对H460膜破坏强，而对正常细胞差异＞65%。血清稳定性优异，24 h预孵后IC₅₀仅增加1.4倍，剩余率近100%。与一线化疗药（ cisplatin、5-fluorouracil、paclitaxel、etoposide）相比，270是唯一TW＞50的药物，且IC₉₅仅为化疗药的1/3至1/8。利用Galleria mellonella幼虫模型进行体内安全性评估，50–120 μM剂量下5天后存活率高（77.8%–88.9%），无黑化或加速体重下降，表明耐受良好。机制上，270引起线粒体去极化、ROS升高和S期细胞增加，但主要作用仍为膜破坏。

快速杀伤与化疗耐药肿瘤抑制的功能验证

Calcein-AM/PI染色显示，111、174-3、209和270在IC₅₀和IC₉₅浓度下均在10小时内完全杀伤H460细胞，270在IC₉₅下2小时杀伤≈90%，远快于依托泊苷。针对 cisplatin、5-fluorouracil、paclitaxel和etoposide耐药的H460细胞系，270对 paclitaxel耐药（DR-PTX）和etoposide耐药（DR-EPT）细胞的IC₅₀甚至低于亲本细胞，表明其对耐药肿瘤有效，机制仍为膜破坏。

优势与局限性

本研究通过膜亲和力重构、 linker激活和N端封端三步设计，系统提升选择性和稳定性，克服AMP疗法常见限制。与现有研究（如PEG化 melittin或BMPA27- melittin conjugate）相比，270具备更佳选择性和活性保持，且不依赖免疫检查点状态，合成更简便。然而，含非天然氨基酸可能带来免疫原性风险，虽G. mellonella模型未显示急性毒性，但需进一步免疫信息学评估和体内验证。此外，缺乏小鼠肿瘤模型实验，未来需扩展剂量递增和器官毒性分析。