SLC6A14通过驱动线粒体融合与氧化磷酸化促进乳腺癌干细胞特性及早发性乳腺癌的机制研究

　　本研究揭示了环境内分泌干扰物DEHP通过上调SLC6A14促进谷氨酰胺摄取和线粒体融合，增强氧化磷酸化（OXPHOS）和三羧酸循环（TCA），从而驱动癌症干细胞（CSC）特性，导致早发性乳腺癌（EOBC）的发生和化疗耐药。靶向SLC6A14为EOBC提供了潜在治疗策略。

　　

Abstract

早发性乳腺癌（EOBC）指45岁前确诊的乳腺癌，与治疗结局差和生存期短相关，但其机制尚不明确。研究发现，塑料增塑剂DEHP作为一种内分泌干扰物，与乳腺癌诊断年龄提前相关。机制上，DEHP通过上调谷氨酰胺转运体SLC6A14增强谷氨酰胺摄取，同时抑制线粒体分裂因子（MFF）加剧线粒体融合，从而通过线粒体融合和谷氨酰胺驱动的氧化磷酸化（OXPHOS）促进肿瘤起始和癌症干细胞特性。抑制SLC6A14可降低干细胞特性、损害肿瘤生长并增敏化疗。这些发现揭示了塑料剂暴露与EOBC相联系的新环境-代谢轴，并确立了SLC6A14作为一个有前景的代谢脆弱点。

1 Introduction

全球EOBC发病率自1990年代以来已上升16%，其独特的医疗、生育、心理和社会挑战亟待解决。年轻患者远处转移和死亡率更高，且预后和对治疗反应更差。尽管遗传易感性是许多研究的焦点，但仅有不到12%的40岁以下乳腺癌女性携带BRCA1或BRCA2突变，绝大多数EOBC病例没有已知的种系基因突变或家族史。大多数EOBC是激素受体阳性亚型，包括管腔A型和B型。值得注意的是，年轻和老年患者之间最大的生存差距发生在管腔乳腺癌中，提示内分泌干扰可能参与EOBC的肿瘤发生和恶性进展。

除遗传因素外，一些生活方式和生殖风险因素也与年轻女性乳腺癌发展有关。增塑剂DEHP作为一种内分泌干扰物，在塑料产品中广泛使用，并在水、河流中的鱼类甚至吸入的颗粒物中被检测到。研究表明，超过70%的美国普通人群和99%的韩国成年人群的尿样中检测到邻苯二甲酸酯代谢物。DEHP具有高吸收潜力，尤其在年轻个体中，并已在胎儿胎盘和头发中被检测到。尽管DEHP在24-48小时内通过尿液排泄，但长期暴露已显示会导致代谢疾病，包括非酒精性脂肪肝病（NAFLD）和肥胖。在乳腺癌患者队列中，较高的尿Σ4MEHP（DEHP代谢物总和）与肿瘤进展、复发风险增加以及包括雌激素受体（ER）和HER2状态在内的临床病理特征相关。东亚学童的每日邻苯二甲酸盐摄入量高于西方国家，这为东亚EOBC更高发生率提供了潜在解释。

肿瘤生物能量学并非严格的Warburg开关模型：糖酵解和线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）通常共存，其平衡受致癌程序、营养和氧气供应以及治疗应激调节。线粒体对于ATP生成、氧化还原控制和通过谷氨酰胺回补作用的前体供应仍然至关重要，当呼吸受限时，通过还原羧化生成乙酰辅酶A/脂质。负责自我更新、分化和肿瘤起始与再生的癌症干细胞（CSCs）同样具有代谢异质性：许多治疗耐受状态表现出升高的线粒体质量/OXPHOS、脂肪酸氧化和融合的线粒体网络，而其他状态偏好糖酵解，程序随生态位信号和细胞状态变化而转变。年轻乳腺癌患者肿瘤中CSCs群体升高，表明增加的癌症干细胞特性可能有助于乳腺癌的早发和不良预后。

“线粒体干细胞特性（Mitostemness）”特征被指定为线粒体依赖性信号功能，包括调节CSC特性维持的线粒体分裂/融合动力学。为了通过线粒体自噬消除功能失调的线粒体来控制线粒体质量，线粒体分裂将单个线粒体分裂成两个短的或碎片化的子线粒体。该过程主要由动力相关蛋白1（DRP1）招募到其接头受体（包括线粒体外膜（OMM）上的线粒体分裂因子（MFF））启动，随后DRP1寡聚化和GTP酶激活形成螺旋结构。为了维持或增强线粒体功能，线粒体融合交换两个紧密接触的线粒体之间的线粒体内内容物，形成细长且互连的线粒体网络。融合过程主要由OMM上的线粒体融合蛋白1和2（MFN1, MFN2）以及线粒体内膜（IMM）上的视神经萎缩蛋白1（OPA1）介导。根据肿瘤的组织类型，CSC干细胞特性和自我更新可以通过线粒体融合和分裂两者增强。然而，线粒体动力学失衡是否参与乳腺癌早发仍不清楚。

在本研究中，发现DEHP暴露与患者乳腺癌早发相关，并在小鼠模型中证实其促进乳腺癌早期肿瘤发生。机制上，DEHP上调谷氨酰胺转运体SLC6A14以增强谷氨酰胺摄取，并通过抑制MFF促进线粒体融合，以满足CSC维持的代谢需求。抑制SLC6A14可抑制DEHP相关的线粒体融合和氧化磷酸化、CSC活性和肿瘤进展。因此，线粒体融合和氧化磷酸化的上调以SLC6A14依赖性方式促进增塑剂相关的乳腺癌早发，靶向SLC6A14被揭示为EOBC患者的潜在治疗策略。

2 Result

2.1 DEHP Facilitates the Early Onset of Breast Cancer

塑料剂暴露，尤其是DEHP，被认为是整体乳腺癌的风险因素，但其在引发乳腺癌早发中的作用尚不清楚。EOBC患者占105名入组患者的36.2%，并显示出可比的分子亚型。为了评估长期DEHP暴露与乳腺癌早期发生之间的关联，我们通过质谱分析测量了乳腺癌患者头发中积累的DEHP水平。乳腺癌患者的平均头发DEHP水平（1.46 fmol mg^?1）远高于健康供体（0.23 fmol mg^?1）。DEHP阳性病例（头发DEHP水平超过健康供体平均水平的10倍（>2.3 fmol mg^?1）在总体患者中占14.3%。与DEHP阴性组（31.1%）相比，DEHP阳性组中EOBC病例的百分比更高（66.7%）。EOBC中的DEHP阳性病例百分比和平均头发DEHP水平显著高于非EOBC。这些发现表明，暴露于DEHP是早发性乳腺癌的关键风险因素。

鉴于肥胖是乳腺癌的另一个生活方式风险因素，我们接下来研究了DEHP暴露与高脂饮食（HFD）对Crl:CD-1 (ICR)小鼠乳腺癌发病率的影响，该品系易患肥胖相关乳腺癌。为了模拟人类暴露水平，根据污染食品中报告的浓度（1.2 ppm）和最高可耐受每日摄入量（8.4 mg/60 kg）选择DEHP剂量。通过基于体表面积的人类等效剂量（HED）计算，因此用0.21 mg kg^?1（低剂量）和1.73 mg kg^?1（高剂量）DEHP处理小鼠。尽管治疗1年后未检测到可触及的肿瘤，但暴露于DEHP的小鼠，无论是正常饮食（ND）还是HFD，均引发乳腺导管内衬上皮细胞的不典型增生，类似于人类癌前病变不典型导管增生（ADH）。该数据表明，仅DEHP暴露就足以启动ADH形成。

我们进一步研究了DEHP暴露在癌基因驱动的肿瘤模型中促进肿瘤起始和进展的作用。尽管MMTV-HER2/neu转基因（HER2-Tg）小鼠模型经典地被认为是HER2阳性乳腺癌的原型，但其肿瘤中的基因表达谱类似于管腔亚型，并且该品系中的肿瘤ERα被DEHP激活。在该品系中，DEHP缩短了肿瘤发生时间，降低了无瘤生存率，并增加了体内乳腺肿瘤的生长速率。此外，与对照小鼠相比，来自DEHP暴露的HER2-Tg小鼠的肿瘤显示出更高的类器官形成能力。这一观察结果通过离体DEHP处理得到证实，该处理导致来自HER2-Tg小鼠对照肿瘤的肿瘤类器官增大。这些发现表明，DEHP暴露显著促进乳腺癌的早期发生和进展。因此，进一步利用DEHP暴露作为模型来探索乳腺癌早发的潜在机制。

2.2 DEHP Exposure Enriches Cancer Stem Cell Populations

肿瘤起始能力归因于更高的癌症干细胞特性活性。基因集富集分析（GSEA）结果显示，在管腔型MCF7乳腺癌细胞中，响应DEHP 10 μM（类似于人类最高可耐受每日摄入量的浓度），干细胞增殖调控显著富集。此外，通过免疫组织化学（IHC）染色和Western blot分析，小鼠肿瘤组织中癌症干细胞标志物（包括CD133以及SOX2和ALDH1）的表达响应慢性DEHP暴露而升高。我们通过评估MCF7细胞的球体形成进一步探讨了DEHP是否促进癌症干细胞特性。短期DEHP处理7天剂量依赖性地增加了球体数量，即使浓度高达100 μM也不影响细胞增殖。为了研究长期DEHP暴露对癌症干细胞特性的影响，用1 μM（DEHP1）和10 μM（DEHP10）DEHP处理MCF7细胞超过一个月。慢性DEHP处理显著刺激了球体形成，并伴有细胞生长的轻微诱导。此外，DEHP1和DEHP10 MCF7细胞在蛋白和mRNA水平上表达更高的癌症干细胞标志物，包括SOX2表达和ALDH活性。有趣的是，DEHP10细胞在球体结构内也显示出SOX2的核表达。

为了证实DEHP对体内癌症干细胞特性的贡献，检查了注射到NOD-SCID小鼠乳腺脂肪垫中的亲本和DEHP10管腔T47D乳腺癌细胞的连续稀释后的致瘤性。该有限稀释试验显示，植入DEHP10 T47D细胞的小鼠表现出更短的无瘤生存率。植入1 × 10³细胞75天后，28.6%的携带DEHP10细胞的小鼠形成了肿瘤，而携带亲本T47D细胞的小鼠均未形成肿瘤。极端有限稀释分析（ELDA）中的CSC频率显示，DEHP暴露组（1/739）比亲本组（1/32177）高43.5倍。此外，患者来源类器官（PDO）以剂量依赖性方式被DEHP诱导。而且，SOX2的表达与乳腺癌诊断年龄呈负相关，并且对乳腺癌早发呈现3.76倍的比值比（OR）。SOX2高表达（SOX2^high）乳腺癌患者的平均诊断年龄比SOX2低表达（SOX2^low）患者年轻。

CSCs由于其固有的抗癌药物耐药性而提出了严峻的消除挑战。值得注意的是，BCRP（一种主动从细胞中排出各种抗癌药物的外排转运蛋白）的过表达已被广泛认为赋予CSCs化学耐药性。MCF7细胞中BCRP的蛋白、mRNA和Hoechst33342外排活性被DEHP诱导。此外，暴露于DEHP的MCF7细胞在细胞生长和克隆形成测定中增加了对化疗药物多柔比星（BCRP的已知底物）的耐药性。这些发现表明，DEHP增强乳腺癌干细胞特性，强调其不仅对早发而且对乳腺癌化疗耐药的潜在贡献。

2.3 DEHP-Enhanced Glutaminolysis Metabolism Upregulates Mitochondrial Respiratory Capacity

为了探索DEHP增强癌症干细胞特性的分子机制，我们检查了RNA测序分析中DEHP相关基因表达谱的改变。基因本体论（GO）注释富集分析的数据揭示了许多与线粒体呼吸相关的基因集的上调。随后的代谢组和转录组数据的联合通路分析显示，DEHP引发了富集的代谢通路，特别是柠檬酸循环。癌症干细胞已被证明在各种癌症类型中比一般癌细胞更依赖线粒体呼吸来产生能量。升高的线粒体融合活性使得CSCs具有干细胞样特性。有趣的是，DEHP增加了线粒体的长度以形成线粒体网络，并伴有MFF蛋白的减少，但不影响mRNA水平，也不影响其他线粒体蛋白的蛋白水平，表明DEHP通过抑制分裂因子MFF的蛋白丰度使线粒体动力学平衡向融合转变。支持线粒体融合增强的是，DEHP处理还增加了用MitoSOX染色的乳腺癌细胞系中的线粒体活性氧（ROS）水平，表明DEHP增强了线粒体融合以增加线粒体呼吸。确实，DEHP诱导了MCF7细胞中的氧消耗速率（OCR），特别是最大线粒体呼吸和备用呼吸能力。通过用氨基氧乙酸（AOA）靶向氨基转移酶抑制谷氨酰胺代谢，或通过用培昔林靶向肉碱棕榈酰转移酶（CPT）抑制脂肪酸β-氧化，而非通过用2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）靶向己糖激酶2抑制糖酵解，主要抑制了DEHP暴露细胞中的最大线粒体呼吸和备用呼吸能力以及线粒体ROS产生。此外，AOA和培昔林抑制了DEHP诱导的乳腺癌细胞系中的球体形成和SOX2表达。在PDO形成中也观察到AOA和培昔林的类似抑制效应。这些结果表明，DEHP诱导的癌症干细胞特性涉及线粒体融合以及随后的谷氨酰胺和脂肪酸代谢重编程。

2.4 DEHP-Induced Glutamine Uptake Enhances the Tricarboxylic Acid (TCA) Cycle and Nucleotide Synthesis via Oxidative Phosphorylation

支持谷氨酰胺分解在DEHP诱导的癌症干细胞特性中的作用，谷氨酰胺剥夺在DEHP处理的MCF7细胞中比在亲本细胞中更大程度地减少了球体形成和SOX2表达。这些发现表明，DEHP重编程谷氨酰胺代谢，使细胞更依赖谷氨酰胺分解来维持干细胞特性。与这些发现并行的是，DEHP暴露在比色测定中增加了细胞内的谷氨酰胺水平。有趣的是，暴露于DEHP的MCF7细胞也显示TCA循环代谢物（包括琥珀酸、富马酸和L-苹果酸）的细胞内水平增加，表明DEHP驱动的谷氨酰胺摄取可能增强TCA循环活性。为了研究细胞内谷氨酰胺水平增加是源于摄取增强还是内源合成，将谷氨酰胺剥夺3小时的细胞重新引入谷氨酰胺。在第四小时观察到最高的细胞内谷氨酰胺水平，并被DEHP增强。这些发现表明，DEHP增强谷氨酰胺摄取以增加线粒体氧化磷酸化。

接下来，用[U-¹³C₅]谷氨酰胺示踪剂进行¹³C代谢流分析（MFA）以进一步量化响应DEHP暴露的谷氨酰胺衍生代谢改变。结果显示，m+5谷氨酰胺、谷氨酸和α-酮戊二酸（αKG）以及m+4琥珀酸和苹果酸的分数富集被DEHP增加。这表明DEHP诱导谷氨酰胺摄取以促进氧化性TCA循环代谢。[U-¹³C₅]谷氨酰胺代谢流增加直至m+4草酰乙酸朝向天冬氨酸，而非柠檬酸和乌头酸。由于天冬氨酸为嘧啶合成提供碳和氮源，谷氨酰胺代谢流可能促进从头核苷酸合成。确实，在代谢组质谱分析中，大多数核苷酸在暴露于DEHP的MCF7细胞中增加。[U-¹³C₅]谷氨酰胺示踪剂的MFA结果进一步证明了DEHP暴露增强了谷氨酰胺驱动的核苷酸生物合成，特别是胞嘧啶、尿嘧啶及其衍生物。这些发现表明，DEHP通过增加谷氨酰胺摄取增强氧化性TCA循环代谢和从头核苷酸生物合成。

2.5 SLC6A14 Upregulation Contributes to DEHP-Induced Glutamine Uptake and Cancer Stemness

在各种谷氨酰胺转运体中，溶质载体家族6成员14（SLC6A14）随后被筛选出作为介导DEHP促进的谷氨酰胺摄取的潜在转运体，因为其在RNA测序分析中响应DEHP暴露而上调。通过RT-qPCR分析和Western blot分析分别进一步验证了DEHP暴露的MCF7细胞中SLC6A14 mRNA和蛋白的显著上调。通过流式细胞术分析进一步观察到DEHP对SLC6A14膜蛋白水平的增加，而非SCL38A2。SLC6A14的表达也在小鼠乳腺肿瘤中以剂量依赖性方式被DEHP诱导。此外，在HER2-Tg小鼠中，SLC6A14表达在较年轻年龄发生的肿瘤中更高，并且与CD133表达和肿瘤生长速率正相关。在年轻乳腺癌患者的肿瘤组织中，SLC6A14的表达更高，比值比为3.896（p值=0.025），并且与诊断年龄负相关。SLC6A14的表达也与肿瘤中SOX2水平正相关，比值比为4.40（p值=0.012），并且与乳腺癌患者的头发DEHP水平正相关。这些临床发现支持SLC6A14被DEHP上调可能有助于癌症干细胞特性，并与乳腺癌早发相关。

2.6 ERα Mediates DEHP-Induced SLC6A14 Expression

增塑剂表现出与雌激素的结构和功能相似性，并被认为是环境激素。先前的研究报道了DEHP与雌激素受体α（ERα）的结合亲和力。在HER2-Tg小鼠中，pERα的表达与SLC6A14水平正相关。我们接下来检查了ERα在DEHP诱导的SLC6A14表达中的参与，结果表明DEHP诱导的SLC6A14表达被氟维司群（一种选择性雌激素受体降解剂（SERD））和ERα shRNA在MCF7和T47D细胞系中剂量依赖性地抑制。氟维司群对DEHP诱导的SLC6A14 mRNA水平的抑制效应也被观察到。这些结果共同表明，DEHP至少部分通过激活ERα转录上调SLC6A14表达。邻苯二甲酸盐共享内分泌干扰通路，但在受体结合和下游激活方面表现出定量差异。与此一致，对接分析预测DEHP与代表性邻苯二甲酸酯代谢物相比具有更强的ERα结合，并且只有DEHP在我们的测定条件下引发了强烈的SLC6A14诱导。这些观察支持一个模型，其中DEHP优先结合ERα有助于SLC6A14上调，同时不排除其他受体或辅助因子的贡献。

2.7 Targeting SLC6A14 Suppresses DEHP-Associated Cancer Stemness and Tumor Progression

支持SLC6A14在DEHP诱导的谷氨酰胺摄取和癌症干细胞特性中的关键作用，DEHP促进的MCF7细胞球体形成被特异性shRNA沉默SLC6A14表达显著抑制。相反，在MCF7细胞中过表达SLC6A14显著增加了球体形成。这些发现表明，SLC6A14在促进癌症干细胞特性中起关键作用。此外，沉默SLC6A14减少了DEHP增强的MCF7细胞中的线粒体融合。相反，SLC6A14过表达和αKG处理抑制了MFF的蛋白水平。用SLC6A14抑制剂α-甲基色氨酸（αMT）预处理抑制了谷氨酰胺摄取。而且，DEHP促进的线粒体融合和ROS产生在MCF7细胞中被αMT抑制。这表明SLC6A14依赖性谷氨酰胺摄取通过抑制MFF表达介导DEHP引发的线粒体融合和呼吸，以促进癌症干细胞特性。

DEHP诱导的球体大小对αMT更显著脆弱，而非对SLC38A2抑制剂α-甲基氨基异丁酸（MeAIB）。类似地，用αMT而非MeAIB处理显著减少了来自DEHP处理的HER2-Tg小鼠的类器官大小。一致地，来自两名乳腺癌患者（PDO-1和PDO-2）的类器官对αMT敏感。支持SLC6A14介导的谷氨酰胺代谢对癌症干细胞特性的贡献，其下游代谢物αKG挽救了MCF7细胞和PDO中由αMT抑制的球体和类器官形成。重要的是，通过αMT抑制SLC6A14显著抑制了来自T47D DEHP克隆的异种移植肿瘤在NOD-SCID小鼠中的生长。IHC染色显示，αMT降低了谷氨酰胺水平，同时抑制了DEHP暴露肿瘤中CD133的表达。

此外，较高的SLC6A14表达与ROC plotter中化疗药物无反应相关。用αMT抑制SLC6A14使暴露于DEHP的MCF7细胞对多柔比星增敏。这些发现共同表明，SLC6A14增强的谷氨酰胺摄取、线粒体融合和随后的谷氨酰胺分解有助于DEHP诱导的TCA循环活性和癌症干细胞特性，导致早发性乳腺癌的发展。因此，SLC6A14是改善EOBC患者治疗结局的潜在靶点。

3 Discussion

除遗传缺陷外，暴露于环境有害增塑剂DEHP被证明通过增强依赖于SLC6A14的线粒体动力学的癌症干细胞特性来促进乳腺癌早发。SLC6A14已被建议作为几种实体瘤的潜在靶点，包括胰腺癌、宫颈癌和结肠癌。高SLC6A14水平在Kaplan-Meier分析中也与乳腺癌进展后生存差显著相关。我们的研究揭示了DEHP激活的ERα对SLC6A14上调和癌症干细胞特性的促进作用。鉴于相当一部分管腔B型癌症是HER2阳性（约41%），我们在ERα响应的MMTV-HER2/neu小鼠模型中的发现支持了DEHP促进的早发轨迹在管腔A型和B型疾病中的合理性。确实，在ERα阳性乳腺癌患者，特别是管腔B亚型患者的肿瘤组织中，观察到更高的SLC6A14和SOX2表达以及更年轻的诊断年龄，进一步证实了ERα/SLC6A14轴在影响癌症干细胞特性以响应DEHP暴露导致乳腺癌早发中的重要性。

CSCs采用独特的代谢通路进行自我更新和化疗耐药，使得能够识别有前景的治疗靶点且潜在不良反应较少。靶向谷氨酰胺代谢在规避乳腺癌化疗耐药方面显示出前景，暗示谷氨酰胺成瘾在许多癌症类型的CSC自我更新中。通过利用谷氨酰胺作为主要代谢源，CSCs在很大程度上依赖线粒体OXPHOS活性通过TCA循环产生主要能量。除了能量生成，αKG衍生的柠檬酸有助于脂质和从头膜合成。此外，谷氨酰胺和αKG衍生的天冬氨酸也作为嘧啶合成的氮和碳供体。嘧啶和脂质合成的增加被认为对癌症干细胞特性的维持至关重要。

为了满足高代谢需求，CSCs表现出分支的线粒体网络以有效供应生物能量物质。暴露于DEHP通过减少MFF表达以SLC6A14依赖性方式增加这种互连的线粒体结构，使线粒体动力学向融合转变。一致地，谷氨酰胺需要通过减少mTOR/MFF/DRP1通路来抑制线粒体分裂。然而，DEHP暴露不改变MFF转录本，表明转录后调控。谷氨酰胺驱动的回补作用扩展了线粒体酰基辅酶A池和营养响应的赖氨酸酰化，以调节蛋白质的多聚泛素化、蛋白酶体周转和功能。SLC6A14的过表达和增加的α-KG通量也降低了MFF蛋白丰度。值得进一步探讨SLC6A14介导的谷氨酰胺摄取是否通过酰化依赖机制影响MFF蛋白稳定性。

肿瘤微环境（TME）中癌细胞和免疫细胞之间存在对谷氨酰胺摄取的竞争。在谷氨酰胺酶缺陷的小鼠肿瘤模型中，癌细胞中受限的谷氨酰胺利用增加了谷氨酰胺对肿瘤浸润T淋巴细胞的可用性，以发挥其抗肿瘤活性。靶向谷氨酰胺转运体，包括SLC1A5、SLC38A1、SLC38A2和SLC6A14，已被提议作为癌症的潜在治疗策略。然而，SLC1A5、SLC38A1或SLC38A2的上调以满足生物能量和生物合成需求也与细胞毒性T细胞的激活和增殖有关。因此，利用CSC对SLC6A14依赖性谷氨酰胺供应的选择性依赖作为代谢脆弱点，对于EOBC患者将是一种有前景的抗肿瘤策略，且对T细胞激活的负面影响较小。谷氨酰胺成瘾的肿瘤细胞竞争性消耗谷氨酰胺以间接将巨噬细胞极化为促肿瘤M2亚型。有趣的是，发现肿瘤组织中的SLC6A14表达与肿瘤相关M2巨噬细胞正相关。因此，选择性靶向肿瘤细胞中的SLC6A14可能不仅抑制CSCs的自我更新，而且减轻谷氨酰胺竞争以将巨噬细胞重新极化为抗肿瘤M1亚型。

属于SLC6家族，SLC6A14被称为氨基酸转运体B^0,+（ATB^0,+），具有广谱底物，包括谷氨酰胺和其他中性阳离子氨基酸。αKG（谷氨酰胺的下游代谢物）对αMT引发的球体和类器官抑制的显著挽救效应表明，SLC6A14主要依赖其谷氨酰胺摄取活性来促进DEHP介导的癌症干细胞特性。尽管我们的SLC6A14遗传扰动和摄取-挽救对照数据支持αMT的靶上机制，但多项研究表明αMT是LAT1（SLC7A5）的底物，并可能参与其他中性氨基酸转运系统。因此，αMT诱导的表型可以反映跨转运体的复合效应，并且不能排除脱靶作用。开发和应用更具选择性的SLC6A14抑制剂将减少脱靶可能性并提高转化潜力。

尽管我们的发现表明头发DEHP水平升高与EOBC相关，但本研究中相对有限的队列规模可能无法为明确的流行病学结论提供足够的统计效力。潜在的混杂因素，如社会经济地位、饮食、激素状态、生活方式以及共同暴露于其他环境污染物，未完全控制，不能排除影响观察到的关联。因此，这些结果强调需要进行更大规模和良好控制的流行病学研究来验证DEHP暴露与EOBC风险之间的联系。

4 Conclusion

总之，我们的研究表明，暴露于DEHP增强乳腺癌干细胞特性，潜在参与早发性乳腺癌的发展。机制上，DEHP诱导SLC6A14上调以促进谷氨酰胺分解、线粒体呼吸能力和涉及谷氨酰胺摄取和线粒体融合的从头DNA合成。通过供应生物能量物质，上调的SLC6A14在增强CSCs自我更新能力中起关键作用。这些发现探索了增塑剂相关早发性乳腺癌的代谢机制。本研究进一步表明，首个FDA批准的SLC6A14抑制剂值得开发作为EOBC患者的新治疗策略，这些患者经常因化疗耐药和侵袭性肿瘤行为面临重大挑战。

5 Experimental Section

人类乳腺癌MCF7、T47D和MDA-MB-231细胞系购自美国类型培养物集存中心（ATCC）。通过长期用DEHP处理超过1个月建立MCF7和T47D细胞系的DEHP暴露克隆。它们在含有1或10 μM DEHP的培养基中维持，分别命名为DEHP1和DEHP10。体外使用的DEHP浓度范围（1–10 μM）基于先前证明其对乳腺上皮和癌细胞具有生物学相关效应的报告选择。所有细胞系在补充有10%胎牛血清、100单位 mL^?1青霉素和100 μg mL