双金属-酚醛框架（Que-Fe-CeMPF）：通过协同生物膜分散、杀菌和免疫调节对抗细菌感染

　　本研究开发了一种新型双金属酚醛框架（Que-Fe-CeMPF），通过槲皮素（Que）与Fe3+和Ce4+自组装构建。该材料在酸性感染微环境中高效催化H2O2生成·OH自由基，破坏细菌细胞壁并导致蛋白泄漏；同时降解胞外DNA（eDNA）瓦解生物膜结构，增强杀菌渗透性。体内外实验证明其能有效清除耐药菌（如铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌），并通过促进巨噬细胞向M2表型极化（上调IL-10、下调TNF-α和IL-6）调节免疫反应，加速感染肺炎小鼠的组织修复。相比抗生素环丙沙星，Que-Fe-CeMPF不易诱导耐药性，是一种多模态非抗生素抗菌策略。

　　

1 引言

抗生素耐药性危机日益严重，传统抗生素对多重耐药病原体效力逐渐下降。生物膜的存在进一步阻碍抗菌剂渗透和免疫清除，亟需开发兼具杀菌、生物膜破坏和免疫调节功能的多模态疗法。活性氧（ROS）如羟基自由基（·OH）和单线态氧（¹O₂）通过氧化损伤细菌膜和DNA，成为对抗耐药菌的有效策略。化学动力学疗法利用感染部位酸性微环境和过量H₂O₂，通过Fenton反应生成·OH，实现选择性杀菌。但·OH寿命短（3–5 μs），且生物膜基质（如胞外DNA eDNA）阻碍其渗透。eDNA作为生物膜关键结构成分，是分散生物膜的战略靶点。尽管脱氧核糖核酸酶（DNase）可水解eDNA，但其活性受pH、Ca²⁺和温度影响，且天然酶分离成本高。纳米酶具有高催化稳定性、易修饰和低成本优势，尤其是兼具eDNA水解和杀菌功能的多模态纳米酶，为耐药感染提供新解决方案。

金属-有机框架（MOFs）作为高比表面积和高催化活性的多孔材料，成为新一代抗菌剂。多酚类化合物（如槲皮素Que）具有抗氧化和抗炎特性，可保护组织细胞免受自由基损伤，并通过调节促炎/抗炎细胞因子平衡免疫反应。多酚作为配体与金属离子（如Fe³⁺、Ce⁴⁺）配位形成金属-酚醛框架（MPFs）。Fe²⁺在酸性环境中催化Fenton反应，加速·OH生成；Ce⁴⁺直接作用于eDNA磷酸二酯键，削弱其结构。将这两种功能整合至单一MPF系统，可同时实现生物膜分散、杀菌和免疫调节。

2.1 Que-Fe-CeMPF的表征

通过一步直接组装法在碳酸钠缓冲液中制备Que-Fe、Que-Ce和Que-Fe-Ce MPFs。SEM和TEM显示三者均由互联小球组成不规则网络结构，zeta电位均为≈-30 mV。HAADF-STEM元素映射表明Que-Fe-CeMPF中碳、氧、铁、铈均匀分布。XPS宽扫描定量显示元素组成为≈77%碳、16%氧、4%铁、3%铈。高分辨率Fe 2p窄扫描显示710.4 eV（Fe 2p_3/2）和723.7 eV（Fe 2p_1/2）特征峰对应Fe²⁺，712.2 eV和725.3 eV峰对应Fe³⁺，卫星峰（716.3和728.8 eV）进一步确认Fe²⁺存在。Ce 3d窄扫描中882.5 eV（Ce 3d_5/2）、886.0 eV（Ce 3d_5/2）、901.9 eV（3d_3/2）和905.5 eV（3d_3/2）峰对应Ce³⁺，883.9 eV、887.5 eV、890.0 eV、904.0 eV、907.0 eV和917.8 eV峰对应Ce⁴⁺。FT-IR光谱中Que的C═O伸缩振动（1665 cm^?1）和C─O伸缩振动（1165 cm^?1）在Que-Fe-CeMPF中移至1641 cm^?1，芳香C─H弯曲振动从820 cm^?1移至825 cm^?1，647 cm^?1处金属-O伸缩振动峰确认金属配位成功。

2.2 Que-Fe-CeMPF的催化活性

通过TMB氧化评估催化活性。在酸性条件（pH 4.5）和H₂O₂存在下，Que-Fe-CeMPF在652 nm处显示最高紫外吸收，催化活性略高于单金属MPFs（Que-FeMPF和Que-CeMPF）。生理pH下催化活性可忽略，无H₂O₂时几乎无活性。游离金属离子（Fe³⁺、Ce⁴⁺及其混合）、游离Que或Que与金属离子混合物的活性均低于Que-Fe-CeMPF。Que-Fe-CeMPF催化活性在不同温度下影响极小，且在SiO₂干燥器中长期储存后仍保持高效。Lineweaver–Burk图推导的动力学参数显示，Que-Fe-Ce对TMB氧化的V_max为442.3 nM s^?1，K_m为10.70 mM，活性高于Fe₃O₄（V_max 97.8 nM s^?1，K_m 154 mM）。

2.3 Que-Fe-CeMPF的体外抗菌活性

在pH 4.5和H₂O₂存在下，Que-Fe-CeMPF对浮游金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌呈现浓度依赖性杀灭，H₂O₂显著增强杀菌效果。pH 7.4时无显著CFU减少，pH 4.5时所有MPFs均显著降低CFU，归因于·OH生成。50 μM Que单独无抗菌作用。Que-Fe-CeMPF在H₂O₂存在下对两种菌株杀灭率达97%，优于单金属MPFs，表明Fe和Ce离子协同作用。SEM显示MPF处理后的细菌出现细胞壁收缩和损伤，并被MPF网络捕获，类似“渔网”机制物理作用细菌表面并通过·OH破坏细胞壁。细胞壁损伤通过细胞内蛋白泄漏证实。·OH的非特异性杀菌机制对革兰氏阳性菌和阴性菌均有高效。

2.4 转录组分析

RNA测序分析Que-Fe-CeMPF和环丙沙星对铜绿假单胞菌基因表达的影响。与PBS组相比，Que-Fe-CeMPF处理差异调节6.2%基因（338个），环丙沙星处理调节5.4%基因（290个）。环丙沙星仅上调51个基因，而Que-Fe-CeMPF上调197个基因，主要涉及膜整合成分基因（如PA0567和PA2862）。下调基因主要涉及病毒基因组过程，如病毒基因组通过宿主细胞膜喷射（如PA0623基因）。GO富集表明Que-Fe-CeMPF组差异表达基因主要与细胞组分（如质膜、膜整合成分、外细胞膜）相关，而环丙沙星组富集于细胞组分和生物过程。KEGG通路分析显示Que-Fe-CeMPF暴露改变铜绿假单胞菌代谢通路，无耐药相关通路变化；环丙沙星处理导致耐药通路基因差异表达。

2.5 Que-Fe-CeMPF的体外生物膜根除

在H₂O₂存在下，Que-Fe-CeMPF对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜的杀灭效率高于单金属MPFs。SEM显示Que-Fe-CeMPF完全破坏生物膜结构，而缓冲液处理组生物膜保持完整。Que-Fe-CeMPF使生物膜结构更开放，归因于基质降解。生物膜厚度、生物量和CFU计数在Que-Fe-CeMPF处理下显著减少，证实固定化Ce⁴⁺和Fe³⁺离子的催化作用加速生物膜分散。

2.6 Que-Fe-CeMPF的生物安全性

通过成纤维细胞、内皮细胞（HUVEC）活力和红细胞溶血评估生物安全性。Que-Fe-CeMPF浓度低于1.6 mM时，细胞活力>80%。50 μM Que或MPFs处理下，成纤维细胞和内皮细胞活力均100%。小鼠红细胞在不同MPFs和Que存在下无溶血，即使Que-Fe-CeMPF浓度高达3.2 mM。

2.7 Que-Fe-CeMPF的体外炎症调节

通过测量巨噬细胞分泌细胞因子评估免疫调节作用。LPS激活巨噬细胞增加TNF-α、IL-6分泌并降低IL-10。Que或MPFs处理激活的巨噬细胞后，TNF-α和IL-6降至未激活水平，Que-Fe-CeMPF显著增加IL-10，表明向M2表型转变。

2.8 Que-Fe-CeMPF在小鼠肺炎模型中治疗铜绿假单胞菌感染

体内评估Que-Fe-CeMPF抗菌活性和抗炎效果。感染后第4天，Que-Fe-CeMPF治疗组生存率83.3%，环丙沙星组66.7%，Que组50%，PBS组33.3%。感染小鼠体重减少10–15%。肺组织CFU计数显示环丙沙星和Que-Fe-CeMPF组比PBS组降低3个对数单位，血液中未检测细菌，PBS和Que组有败血症风险。细胞因子水平显示，环丙沙星、Que和Que-Fe-CeMPF均降低TNF-α，IL-6无显著差异，但环丙沙星和Que-Fe-CeMPF诱导IL-10增加两倍。免疫荧光显示Que-Fe-CeMPF和环丙沙星处理组肺髓过氧化物酶（MPO）水平更低，CD206（M2标记）表达更强，表明向抗炎M2表型转变。H&E染色显示Que-Fe-CeMPF处理组肺泡结构完整类似健康小鼠，环丙沙星组肺条件较差，PBS和Que组肺泡融合和充气不全。其他主要器官无显著变化，血液生化无差异，但PBS组白细胞（WBC）和血红蛋白参数（MCH、MCV、MCHC）更高，可能因细菌感染。

3 讨论

Que-Fe-CeMPF在酸性条件下抗菌活性增强，双金属引入不影响zeta电位或形态。其核酸酶模拟活性水解生物膜基质，促进分散，增强杀菌渗透。Fenton反应加速·OH生成，破坏细胞壁导致蛋白泄漏和细菌死亡。酚羟基在酸性环境中与细菌细胞壁多糖、膜蛋白和肽聚糖形成氢键，缩短·OH源与细菌距离，提高效率。·OH短寿命和低pH生成确保健康组织安全。相比靶向特定细菌组分的传统抗生素，Que-Fe-CeMPF多靶点机制降低耐药风险。

金属纳米材料通过ROS诱导氧化应激发挥抗菌作用，但存在非特异性细胞毒性风险。感染部位酸性和富H₂O₂特性（源于免疫反应氧化爆发和代谢酸产物）允许选择性ROS生成。Fe²⁺在酸性条件下催化效率高，但天然低H₂O₂水平（≈100 μM）限制·OH生产，外源添加H₂O₂可能损伤健康组织。增强低浓度H₂O₂向·OH转化是关键。

Que-Fe-CeMPF在酸性条件下具本征催化活性，无需光激发，克服光依赖策略的组织穿透限制。Que加速Fe³⁺→Fe²⁺生成，维持催化链反应，MPF纳米网络促进H₂O₂吸附和转化。催化活性在pH 4.5至7.4间显著降低，实现感染部位选择性·OH生成，平衡疗效和安全性。

生物膜基质eDNA的磷酸二酯键在中性pH下抗水解，是分散挑战。Ce⁴⁺等酸性Lewis金属离子赋予纳米酶核酸酶模拟能力，Ce复合物活性优于传统Zn和Mg模拟物。Que-Fe-CeMPF中Fe³⁺和Ce⁴⁺协同作用，增强生物膜基质水解效率。

感染控制后免疫调节对组织修复至关重要。M2巨噬细胞促进血管生成和成熟，但细菌感染后M1向M2转变常延迟。Que-Fe-CeMPF有效刺激巨噬细胞向M2表型极化，上调IL-10、下调TNF-α和IL-6。其他策略如铜基MOF嵌入Ag或近红外触发NO释放可促进愈合，但受组织穿透和外部照射限制。Que-Fe-CeMPF无需光激活，提供更实用选择。临床优先事项在控制细菌负荷后转向组织再生，Que-Fe-CeMPF独特结合杀菌、免疫调节和促进修复，应对复杂耐药感染。生存率未达100%，可能需延长治疗期彻底清除生物膜细菌。

4 结论

成功设计具有多模态活性的双金属-酚醛框架Que-Fe-CeMPF，在酸性条件下实现杀菌、生物膜降解和炎症调节。催化H₂O₂生成·OH，破坏细菌细胞壁，导致蛋白泄漏和死亡；调节免疫反应，诱导巨噬细胞M2表型，增强免疫调节和组织修复。体内治疗铜绿假单胞菌肺炎显示比游离Que和环丙沙星更快杀菌和肺组织恢复。不直接影响耐药通路，降低细菌耐药性发展风险。多模态活性有效控制耐药细菌感染并加速愈合。

5 实验部分

通过槲皮素与Fe³⁺和Ce⁴⁺离子在碳酸钠缓冲液中直接组装合成Que-Fe-CeMPF，透析纯化后冻干。使用Zeta电位仪、SEM、TEM、XPS、FT-IR表征。催化活性通过TMB氧化测定，动力学参数由Lineweaver–Burk图推导。抗菌活性通过CFU计数、SEM、CLSM和蛋白泄漏评估。转录组分析通过RNA测序和GO/KEGG富集进行。生物膜实验包括CFU计数、结晶紫染色、CLSM和SEM。生物安全性通过细胞活力CCK-8 assay和溶血实验评估。免疫调节通过ELISA测量细胞因子。小鼠肺炎模型通过气管内接种铜绿假单胞菌建立，治疗后评估生存率、CFU、细胞因子、组织H&E染色和免疫荧光。数据以均值±标准差表示，单因素ANOVA统计分析。