阿尔茨海默病多基因风险评分（optPRS）与认知轨迹及脑类器官表型的关联研究揭示遗传风险分层新策略

　　【编辑推荐】本研究优化了阿尔茨海默病（AD）多基因风险评分（optPRS），证实其可独立于APOE基因预测AD痴呆和Aβ阳性，且与认知衰退速率显著相关。通过诱导多能干细胞（iPSC）衍生的脑类器官模型，首次发现高optPRS组存在Aβ不溶性增强和tau蛋白磷酸化（p-tau）水平升高，为AD遗传风险评估和药物筛选提供了新型生物学平台。

　　

1 引言

阿尔茨海默病（AD）作为最常见的神经退行性疾病，除众所周知的载脂蛋白E（APOE）基因外，还受到多遗传因素的影响。多基因风险评分（PRS）通过整合全基因组关联研究（GWAS）鉴定的单核苷酸多态性（SNP）效应，已成为区分AD高遗传风险个体的重要工具。然而，PRS的临床应用仍受限于其在不同人群中的普适性不足，且既往研究多基于欧洲人群，其在亚洲人群尤其是东亚人群中的适用性存疑。本研究团队前期工作通过评估东西方人群间AD PRS的可转移性，证实其在亚洲背景下的实用性。先前评估AD PRS时使用了39个SNP，因此开发具有更佳稳健性的更新版PRS对推进深入分析至关重要。

尽管已有大量关于AD PRS的研究，但较少纳入淀粉样蛋白β（Aβ）生物标志物来探究其与认知轨迹的关联。既往研究表明，除APOE基因外的PRS可预测AD或轻度认知障碍（MCI）向AD痴呆（ADD）的转化，但这些研究缺乏Aβ生物标志物。另有研究显示AD PRS在识别MCI方面具有效用，但该发现仅限于50多岁的参与者。其他研究还证明较高的AD PRS与更显著的皮质厚度和海马体积异常相关。近期一项研究探讨了PRS与Aβ阳性认知未损（CU）个体认知衰退的关联，但当从PRS中排除APOE后，该关联不再显著。PRS是否影响AD的纵向认知轨迹，尤其是在与Aβ沉积相关的背景下，仍属未知。

利用诱导多能干细胞（iPSC）衍生的脑类器官模型可有效验证由PRS决定的AD真实遗传易感性。该方法能排除个体终生环境因素的影响，高度有效地识别遗传效应。源自AD患者成纤维细胞或外周血单核细胞（PBMC）的iPSC可分化为呈现AD相关病理的神经元或胶质细胞。脑类器官包含各种脑细胞类型，允许细胞外Aβ聚集体形成和随后的tau蛋白病（如tau过度磷酸化），从而更有效地重现AD进展。脑类器官模型的有效性已通过与供脑病理特征的比较得到证实，凸显了其在AD研究中的潜在效用。尽管大量研究利用类器官模型探讨了APOE等单一遗传因素在AD中的作用，但尚未有研究探索PRS的作用。此外，关于哪些表型最能代表疾病进展的重要问题仍然存在。

本研究首先通过修改先前开发的PRS的SNP组分来优化PRS，从而开发出更精确的PRS组合，并随后验证其在预测ADD和Aβ阳性方面的性能。其次，研究了优化后的PRS（optPRS）与认知轨迹的关联，评估了这种关联是否因Aβ阳性状态而异。最后，分析了来自高、低风险PRS组代表性个体的iPSC衍生的脑类器官中的Aβ和tau表达水平。通过将遗传风险分层与先进细胞模型相结合，本研究旨在更深入地了解PRS在AD中的临床效用， potentially 为个性化风险评估和靶向干预策略提供依据。

2 方法

2.1 研究参与者

本研究招募了2013年1月至2019年7月期间访问韩国25个中心记忆门诊的1634名参与者。其中1255名参与者来自三星医学中心，202名来自KBASE（韩国脑老化研究用于阿尔茨海默病早期诊断和预测）多中心研究，99名来自基于痴呆队列的多中心临床研究平台，共同构成用于验证的数据集1。此外，379名参与者来自Biobank Innovation for chronic Cerebrovascular disease with ALZheimer's disease Study (BICWALZS)，构成用于复制分析的数据集2。

所有参与者均接受了神经心理学测试、脑磁共振成像（MRI）和Aβ正电子发射断层扫描（PET）（¹⁸F-florbetaben [FBB]或¹⁸F-flutemetamol [FMM]）扫描。Aβ PET采集和分析的详细信息见补充材料。认知连续体的综合征分期包括认知未损（CU）、遗忘型轻度认知障碍（aMCI）和AD痴呆（ADD）。

在这1225名参与者中，771人在基线Aβ PET扫描前后3年期间完成了至少两次随访神经心理学测试，包括韩国版简易精神状态检查（K-MMSE）和临床痴呆评定量表总和（CDR-SB）。因此，771名参与者被纳入纵向认知轨迹分析。

为进一步评估PRS在东亚人群中的普适性，纳入了来自英国生物银行（UK Biobank）申请号33002下的中国个体独立队列作为数据集3。在1741个可用样本中，1442个个体有通过质量控（QC）的遗传数据，其中15人被诊断为ADD。详细信息见补充材料。

2.2 基因分型和插补

DNA样本使用Illumina亚洲筛查阵列BeadChip（ASA Chip, Illumina, CA, USA）进行基因分型（n=1509）。部分样本（n=125）使用Affymetrix定制韩国生物银行阵列芯片（Affymetrix, CA, USA）进行基因分型。

SNP数据的质量控制（QC）使用PLINK 2.0版软件进行，插补使用密歇根大学插补服务器上的Minimac4软件进行。QC和插补过程按照我们先前工作中报道的方法进行。

为评估和控制人群分层，使用EIGENSOFT对全基因组SNP数据进行主成分分析（PCA）。为进行祖先推断和验证，我们将研究基因型数据与1000基因组计划的参考基因型数据合并，在匹配SNP并进行QC以保留常见、高质量变异后，在参考面板上进行PCA，然后将我们的队列样本投影到由1000基因组计划定义的主成分（PC）空间中。该分析的前四个PC捕获了遗传变异的主要轴心并最大限度地减少了由于种群结构造成的混淆，被纳入所有关联分析作为协变量。

对于UK Biobank队列（数据集3），使用Affymetrix UK BiLEVE Axiom阵列或Affymetrix UK Biobank Axiom阵列（UKBB Version 3; March 2018）进行基因分型，覆盖超过80万个SNP。经过QC和插补后，1442名拥有高质量遗传数据的中国个体被纳入本次分析。UK Biobank样本的详细QC和插补程序在补充材料中描述。

2.3 PRS构建

使用来自欧洲国际阿尔茨海默病基因组计划（IGAP）GWAS的汇总统计（来自21,982例AD病例和41,944例对照的11,480,632个SNP）来构建韩国人群的PRS。基于先前数据，我们排除了APOE周围（染色体19, 44,400–46,500 kb, GRCh37/hg19）的3877个SNP，以确保PRS独立于APOE区域。PRS生成使用PRSice-2进行，以IGAP GWAS汇总统计作为推导数据集。为推导预测模型，我们评估了在p值阈值（范围从5×10^?8到1.0）和连锁不平衡（LD）聚类r²值（0.1–0.9 within 1000 kb）范围内的SNP纳入情况，使用数据集1（n=1255名韩国个体）的数据。应用逻辑回归模型来识别最大化Nagelkerke's r²值（模型解释的方差度量）的阈值组合。

通过上述过程，先前研究中初步选择了39个SNP（定义为PRS39）。为确保在我们韩国队列中的一致性和稳健性，我们进一步排除了8个效应方向（β）与IGAP参考相反的SNP，最终得到31个SNP集。使用这个精炼的31个SNP集，我们生成了优化的PRS，称为optPRS。个体optPRS计算为风险等位基因的加权和，使用来自IGAP GWAS的β系数，通过PLINK计算。每个个体的optPRS计算为每个SNP的效应等位基因（0, 1, 或 2）数量乘以其相应β系数的总和。最终的optPRS在关联分析之前进行了标准化（z-score）。

对于基于组的分析，根据其分布将optPRS分为四分位数：第一四分位数（0-25百分位数，最低optPRS值），第二四分位数（25至50百分位数），第三四分位数（50至75百分位数）和第四四分位数（75至100百分位数，最高optPRS值）。在iPSC衍生的脑类器官实验中，参与者被进一步分为低optPRS组（第一和第二四分位数）和高optPRS组（第三和第四四分位数）。相同的方案应用于独立复制队列（数据集2和3）以验证optPRS的预测性能。SNP选择和效应大小的详细信息见表S1。

2.4 optPRS用于AD的验证和复制

计算每位参与者的optPRS后，我们进行了逻辑回归分析，以确定基于欧洲人群汇总统计得出的ADD风险optPRS是否与研究中的ADD相关，调整了年龄、性别、教育年限、APOE ε4携带者状态和遗传祖先的前四个PC。为验证optPRS与ADD的关联是否随APOE ε4携带者状态而变化，我们在将数据集1中的参与者分层为APOE ε4携带者和非携带者后进行了相同的分析。此外，我们使用复制集（数据集2和3）复制了该分析，以确认optPRS与ADD之间的关联，调整了相同的协变量。

2.5 iPSC的生成

我们从低optPRS组选择了四名参与者，从高optPRS组选择了三名参与者。iPSC系由每位参与者的PBMC产生，使用CytoTune-iPS 2.0 Sendai重编程试剂盒（Thermo Fisher, #A16518）导入重编程因子，按照制造商方案进行。细胞在mTESR1培养基（Stemcell Technologies, #ST85850）中培养，培养板包被有iMatrix 511 silk（Nippi, #892-021）。传代时使用2 mM乙二胺四乙酸（EDTA），并在培养基中加入Y27632（Selleckchem, #S1049）24小时内。

2.6 脑类器官的生成和表征

iPSC被解离并通过160×g离心5分钟收集。然后将iPSC以0.9×10⁴ cells/well的密度接种到预涂有1% Pluronic acid（Sigma-Aldrich）的V形96孔板（Corning）中。细胞在适当的培养基中培养以生成脑类器官，如先前所述，并维持至第60天，此时对它们进行取样用于免疫组织化学、免疫印迹或酶联免疫吸附测定（ELISA）。选择这个时间点是基于先前的研究，该研究观察到在携带APP基因瑞典K670N/M671L双突变（称为APPswe）的AD脑类器官模型中，与对照组相比，培养60天后Aβ积累增加。在这个60天阶段，存在兴奋性神经元，神经祖细胞仍然活跃。相反，胶质细胞（包括星形胶质细胞）很少观察到，因为它们通常预计在培养约3个月后变得更加普遍。详细方案见补充材料。本研究中使用的关键试剂和资源详情见表S2。选择60天时间点是基于先前的发现，即来自常染色体显性AD突变患者iPSC的脑类器官在培养2个月后显示Aβ积累，而来自晚发性AD患者的iPSC则稍晚呈现这些表型，可能是由于胶质细胞群增加。鉴于我们假设高optPRS加速AD病理，我们分析了2个月大的类器官。

2.7 统计分析

分类变量使用卡方检验（χ²）进行比较，并以频率（百分比）呈现。连续变量使用Student's t检验进行分析，并以均值±标准差呈现。

使用线性混合效应模型研究optPRS对时变K-MMSE和CDR-SB评分的影响。我们纳入了以下固定效应：年龄、性别、APOE ε4携带者、认知状态（分类为CU、aMCI或ADD）、基线与每个随访时间点之间的时间间隔（t）、optPRS和时间间隔（t）的双向交互项。患者被纳入为随机效应。此外，我们通过将参与者分为Aβ+和Aβ-组进行了亚组分析，以及在每个认知状态组（CU、aMCI和ADD）内进行了分层分析。

统计学显著性设定为双尾检验p值<0.05。所有统计分析和结果可视化均使用R 3.6.1版（R Project for Statistical Computing）进行。

类器官图像使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）进行分析。在每个类器官表面选择一个200×200 μm²的区域进行分析。信号量化通过将每个信号的平均强度值乘以相应区域以获得总信号来进行。Aβ颗粒分析使用ImageJ中的Analyze Particles插件进行，计数大于0.1 μm²的颗粒以确定指定区域中的颗粒总数。使用未配对t检验比较来自低optPRS和高optPRS类器官的Western blotting和ELISA结果。此外，估计Pearson相关系数以检查不溶性/可溶性Aβ42比率与p-tau181水平之间的相关性。使用GraphPad Prism 10.1.2版分析数据。

3 结果

3.1 参与者

数据集1包括1255名参与者，平均（标准差）年龄为72.2（8.9）岁（739名女性，58.9%）。数据集2包括379名参与者，平均（标准差）年龄为69.8（9.3）岁（230名女性，60.7%）。与1000基因组计划数据进行的PCA显示，我们的数据集与其他东亚人群的种族重叠。在这些参与者中，771名参与者有纵向随访数据，他们在基线Aβ PET扫描前后3年期间完成了至少两次神经心理学评估。该亚组的平均（标准差）年龄为70.5（8.5）岁，其中59.1%为女性。

按遗传风险组（optPRS四分位数组）分层的参与者详细临床特征见表1。在年龄、性别、教育年限、APOE ε4携带者患病率、基线K-MMSE评分和基线CDR-SB评分方面没有统计学显著差异。

3.2 optPRS的生成和复制

为确定PRS生成的最具预测性的参数，我们使用来自IGAP GWAS的汇总统计应用了PRSice-2。对于PRS39，当p值阈值和LD聚类r²值分别设置为4.15×10^?6和0.1时，观察到最高的Nagelkerke R²值（0.020）。为增强稳健性，我们排除了八个与IGAP参考相比具有相反效应方向（β）的SNP，生成了optPRS，其实现了更高的Nagelkerke r²值0.023。

在数据集1中，optPRS与ADD风险增加显著相关，每SD增加的比值比（OR）为2.44（95%置信区间[CI]：1.65?3.62, p=8.30×10^?6），而PRS39显示每SD增加的OR为1.95（95% CI：1.40?2.72, p=2.27×10^?5）。对于Aβ沉积也观察到类似模式：optPRS每SD增加的OR为2.05（95% CI：1.37?3.09, p=5.07×10^?5），而PRS39为1.81（95% CI：1.32?2.48, p=2.23×10^?4）。Nagelkerke's r²和OR值来自逻辑回归模型，调整了年龄、性别、教育年限、APOE ε4携带者状态和遗传祖先的前四个PC。数据集2中的复制分析证实了optPRS与ADD之间的关联（每SD增加的OR=2.08, 95% CI：1.19?3.67, p=0.011），再次优于PRS39（每SD增加的OR=1.85, 95% CI：1.05?3.32, p=0.040）。对于数据集2中的Aβ沉积，optPRS每SD增加的OR为1.92（95% CI：1.12?3.34, p=0.004），而PRS39为1.89（95% CI：1.11?3.28, p=0.021）。为进一步评估普适性，我们分析了UK Biobank中国队列（数据集3），其中optPRS仍然与ADD显著相关（每SD增加的OR=1.97, 95% CI：1.17?3.32, p=0.011），优于PRS39（每SD增加的OR=1.73, 95% CI：1.03?2.91, p=0.038）。

我们进一步检查了optPRS四分位数和APOE ε4携带者状态对ADD和Aβ沉积的联合效应。我们观察到，在APOE ε4携带者和非携带者中，ADD和Aβ沉积的风险随着optPRS四分位数逐步增加。值得注意的是，与第一optPRS组中的APOE ε4非携带者相比，第四optPRS组中的APOE ε4携带者显示ADD风险增加7.37倍（95% CI：4.30?13.16），Aβ阳性风险增加16.26倍（95% CI：9.08?30.76）。

3.3 optPRS对认知轨迹的影响

在纵向分析中，较高optPRS四分位数的参与者显示出更快速的认知衰退和疾病严重程度的更快进展，分别通过K-MMSE（趋势p=0.005）和CDR-SB评分（趋势p=0.002）测量。

在纵向分析中，与第一optPRS四分位数相比，第四optPRS四分位数的参与者显示出更快速的认知衰退和疾病严重程度的更快进展，分别通过K-MMSE（p=0.004）和CDR-SB评分（p=0.004）测量。此外，较高的optPRS四分位数或较高的optPRS评分与更快速的认知衰退和疾病严重程度的更快进展相关，分别通过K-MMSE（趋势p=0.005；p<0.001）和CDR-SB评分（趋势p=0.002；p<0.001）测量。

此外，我们发现这种关联在Aβ+个体中更为显著。在Aβ-组中，optPRS对认知衰退速率或疾病严重程度没有显著影响。然而，在Aβ+组中，第四optPRS四分位数的参与者显示出更快速的认知衰退和疾病严重程度的更快进展，分别通过K-MMSE（p=0.009）和CDR-SB评分（趋势p=0.016）测量。在Aβ+组中，较高的optPRS四分位数或较高的optPRS评分与更快速的认知衰退和疾病严重程度的更快进展相关，分别通过K-MMSE（趋势p=0.016；p=0.003）和CDR-SB评分（趋势p=0.009；p=0.003）测量。

当按认知状态（CU、aMCI和ADD）进行分层分析时，具有较高optPRS评分的aMCI患者显示出更快的疾病严重程度进展，通过CDR-SB测量（p=0.038）。

3.4 iPSC衍生和脑类器官生成

为生成iPSC，我们从低optPRS组（第一和第二四分位数）选择了四名个体，从高optPRS组（第三和第四四分位数）选择了三名个体。高optPRS组的PBMC供体比低optPRS组表现出更快速的MMSE评分认知衰退（p=0.003）。我们确认了所有生成的iPSC系的正常染色体正常性和多能性。iPSC生成过程中的 rejuvenation 最小化了衰老和环境因素的参与，同时最大化PRS的遗传贡献，该策略可以代表PRS依赖的AD发展。iPSC系在三星医学中心生产，并转移至大邱庆北科学技术院，optPRS组信息在实验和分析结束前处于盲态。

从这些iPSC中，开发了脑类器官以研究PRS依赖的AD相关表型差异。在创建脑类器官过程中，高optPRS组的所有系（#3、#4和#6）在第一和第二批次中产生非常小或没有脑类器官。在第三分化批次中，我们成功地从所有用于进一步分析的系中生成了可分析的脑类器官。然而，来自高optPRS组的#6持续表现出 persistently poor 类器官形成，导致下游生化分析样本不足，随后被排除在进一步分析之外。

3.5 脑类器官模型中AD相关病理表型分析

对脑类器官的Aβ免疫染色显示，与低optPRS组相比，高optPRS组倾向于存在更普遍的较大颗粒。在相同时间点对脑类器官进行的免疫印迹也显示Aβ表达没有差异。然而，tau过度磷酸化（pT217和pS396）在高optPRS组中显著增加。

由于我们在高optPRS组的免疫荧光图像中观察到Aβ聚集体增加，但在使用RIPA缓冲液裂解的部分中没有发现Aβ水平差异，我们通过ELISA分别测量了RIPA可溶性和不溶性Aβ。然而，在高optPRS组中，可溶性Aβ42显著降低（p=0.020），但不溶性Aβ42水平与低optPRS组相比没有差异，表明高optPRS组中Aβ42的不溶性部分增加。不溶性/可溶性Aβ42比率在高optPRS组中显著高于低optPRS组（p=0.030）。此外，p-tau181水平在高optPRS组中高于低optPRS组（p=0.002），与免疫印迹结果一致。还观察到不溶性/可溶性Aβ42比率与p-tau181水平之间存在相关性（p=0.040）。这些结果表明高PRS与Aβ不溶性增加和tau磷酸化相关。

4 讨论

在本研究中，我们将先前开发的PRS修改为optPRS，其显示出对ADD和Aβ阳性预测性能的改进。高optPRS与更快速的认知衰退显著相关，尤其是在Aβ+个体中。此外，我们证实来自高optPRS患者的iPSC衍生的脑类器官与来自低optPRS患者的类器官相比，与增加的Aβ不溶性和p-tau水平相关。综上所述，具有高optPRS（表明独立于APOE的AD遗传易感性）的AD患者表现出更快速的进展，并且这种现象在个体化类器官模型中得到复制。我们的发现增强了optPRS临床应用的潜力。

我们通过精炼SNP组分并纳入Aβ生物标志物，成功开发了optPRS，为ADD风险预测创建了一个稳健且准确的PRS模型，适用于韩国血统个体。先前的PRS研究主要集中于欧洲人群的临床诊断AD，并且通常缺乏Aβ生物标志物。尽管一项法国队列研究包含了Aβ数据，但其仅限于CU个体，并在欧洲为基础的倡议（如ADNI和EADI研究）中进行验证。optPRS在ADD和Aβ阳性个体中表现出强大的预测性能，独立于APOE基因型。通过在韩国队列中验证optPRS并进一步证明其与UK Biobank中国参与者ADD的关联，我们的研究弥合了我们的PRS模型普适性方面的差距。然而，鉴于东亚内部的遗传多样性，需要在其他亚洲群体中进行进一步验证。这强调了在AD遗传研究中纳入多样化人群以反映AD复杂遗传结构的重要性。

此外，optPRS展示了其在预测ADD预后方面的性能，显示出与K-MMSE和CDR-SB评分测量的认知轨迹的显著关联，尤其是在Aβ+参与者中。尽管早期研究主要调查横断面队列中的PRS，但我们的研究证明了PRS与纵向队列中认知衰退的显著关联，尤其是在韩国人群中。这突显了最初基于IGAP GWAS构建的PRS模型在不同遗传背景下的广泛适用性。先前的一项PRS模型研究仅关注CU老年人，发现与认知衰退的关联仅由APOE基因型驱动。相比之下，我们的研究包括了CU、aMCI和ADD参与者，并表明optPRS与纵向认知衰退相关，无论APOE状态如何，尤其是在Aβ+个体中。按认知状态的分层分析显示，在aMCI中，较高的optPRS与更快的疾病严重程度进展相关，表明在此阶段PRS效应更强。我们的发现强调了optPRS在预测随时间推移的认知衰退方面的效用，并表明optPRS在存在Aβ病理的情况下更好地反映了疾病进展。这些发现强调了按遗传风险和Aβ状态对患者进行分层以精确评估ADD纵向认知轨迹的重要性。

最后，我们在个体化脑类器官模型中证实了PRS依赖的Aβ不溶性增加和tau过度磷酸化。我们从具有高和低optPRS的供体的PBMC生成iPSC，并开发了脑类器官。这种方法对于验证optPRS的效用特别有用，因为它消除了环境因素的影响，并且仅表现出遗传易感性的影响。尽管类器官模型已被广泛用于研究APOE ε4在AD中的作用，但PRS在此类模型中的潜在应用仍属未知。来自高optPRS个体的脑类器官与低optPRS组相比，表现出更高的不溶性/可溶性Aβ42比率和增加的tau磷酸化（p-tau217、p-tauS396和p-tau181）水平。尽管总Aβ水平没有显著差异（可能因为所有参与者都是Aβ PET阳性），但高optPRS组中的Aβ42更集中，表明聚集和不溶性增强。tau磷酸化水平与不溶性/可溶性Aβ42比率显著相关，与Aβ聚集加速tau病理的假设一致。这些结果表明高optPRS水平有助于体外疾病相关生物标志物的表达。此外，高optPRS组的PBMC供体比低optPRS组表现出更严重的认知衰退，表明PRS水平反映了疾病侵袭性。这些数据不仅证明了PRS-脑类器官模型在阐明驱动AD病理机制方面的价值，而且突出了其预测AD症状发作和轨迹的潜力。此外，按PRS分层的脑类器官模型可能作为筛选新型疾病修饰疗法药物的平台，支持个性化治疗策略的开发。随着AD脑类器官技术在精准医学中的不断进步，我们的发现——显示AD相关病理随PRS而变化——突出了它们的潜在效用。这些模型可能有助于早期识别遗传风险个体，并能够根据遗传风险谱评估药物疗效。未来的研究应进一步表征低和高optPRS类器官，以确定针对每个亚组的有效治疗方法。

出乎意料的是，我们观察到来自高optPRS组iPSC的脑类器官形成存在系特异性缺陷。尽管所有iPSC系的形态没有显著差异，但这种现象在前两个实验批次中一致存在。值得注意的是，iP