畸形神经元表达抑制性甘氨酸能信号标记物：揭示局灶性皮质发育不良IIb型的新治疗靶点

　　本研究创新性地结合深度学习与空间转录组学技术，首次构建了FCD IIb的解剖转录图谱，揭示畸形神经元（CDNs）异常表达甘氨酸转运体2（GlyT2/SLC6A5）等抑制性信号分子，为耐药性癫痫提供了潜在治疗新靶点。

　　

3.1 Specimen-level histomorphologic-based tissue segmentation mirrors local spatial patterns of RNA expression in FCD IIb

局灶性皮质发育不良II型（FCD IIb）的致病关键细胞——巨大型畸形神经元（CDNs）在切除组织标本中占比极低（仅0.01–0.001%），这给其分子表征带来巨大挑战。为解决这一问题，研究团队采用经预训练的卷积神经网络（CNN）对多张全切片图像（WSIs）进行深度学习特征向量（DLFVs）提取，通过层次聚类（Ward法）在K=7的聚类方案下实现了跨玻片的组织形态学自动分区。该方法不仅精准识别出CDNs、气球样细胞（BCs）和白质稀疏区等病理特征区域，还成功将不同玻片间形态相似的区域归为同一类别，创建了客观的样本内重复区域。

研究进一步将深度学习划分的组织区域与空间转录组（spRNAseq）聚类结果进行比对，发现两者具有高度一致性。通过生成与spRNAseq斑点坐标对齐的伪斑点并进行Dice评分分析，证实了组织学定义的区域能准确反映分子表达的空间模式。UMAP可视化显示转录组数据更倾向于按形态学聚类而非玻片来源聚集，传统标记物如灰质标志SYT1/SYP和白质标志MOBP/MBP的表达模式也验证了分区结果的生物学合理性。这一突破表明计算病理学方法能有效指导空间转录组捕获区域的选择，显著提高罕见细胞类型的采样效率。

3.2 Spatial transcriptomic analysis of FCD IIb identifies SLC6A5 as a specific marker of CDNs

通过对多玻片空间转录组数据进行无监督图谱聚类，研究成功分离出覆盖CDNs的捕获点（spots）。差异表达分析显示，CDNs区域显著上调神经丝重链（NEFH）和中链（NEFM）等已知标志物，同时意外发现甘氨酸转运体2编码基因SLC6A5（p<0.0001）、Rho GTP酶激活蛋白36（ARHGAP36）和前强啡肽原（PDYN）的特异性高表达。UMAP分析表明SLC6A5、ARHGAP36和PDYN的表达相较于传统标记物NEFL具有更高的空间特异性，与CDNs的分布高度重合。

为验证这一发现，研究团队在8例独立FCD IIb存档样本中进行了免疫组化验证。结果证实SLC6A5（GlyT2蛋白）和ARHGAP36在CDNs中普遍高表达，且特异性优于NEFL。值得注意的是，SLC6A5的表达在CDNs中呈现高度集中模式，而在周围正常皮质结构中几乎缺失。同时研究还发现囊泡抑制性氨基酸转运体（VIAAT/SLC32A1）在CDNs中协同上调，提示完整的甘氨酸回收通路可能被异常激活。

4 DISCUSSION

本研究通过深度学习驱动的空间转录组分析，首次构建了FCD IIb的高分辨率转录图谱，揭示了CDNs中抑制性甘氨酸能信号通路的异常激活。SLC6A5（GlyT2）作为神经元甘氨酸回收的关键转运体，其异常表达可能通过破坏抑制性神经传递参与皮质过度兴奋的病理过程。这一发现具有重要转化价值：GlyT2抑制剂已被用于中枢神经系统疼痛疾病的研究，有望成为治疗FCD IIb的新靶点。

研究方法学上的创新同样值得关注。开发的跨玻片深度学习分析流程（可通过CODIDO平台获取）能够标准化地识别病理组织模式，显著提高了空间转录组研究的针对性和可重复性。该技术与PHARAOH平台上的专业分类器结合使用，可为罕见病研究提供客观的区域选择指导。

研究也存在一定局限性：基于单个新鲜样本的转录组分析可能需要更多样本验证；GlyT2在FCD IIb中的功能机制尚需实验验证；研究结果在FCD IIa和结节性硬化症等类似疾病中的普适性有待进一步探索。

未来研究方向包括：深入解析甘氨酸能信号在CDNs中的功能作用；开发针对GlyT2的靶向治疗策略；拓展该计算病理学方法在其他脑疾病研究中的应用。