基于分层计数模型的scATAC-seq数据分析挑战与高分辨率信息挖掘新机遇

　　为解决scATAC-seq数据极端稀疏性、技术偏差和单细胞分辨率解读难题，研究人员开发了分层计数模型。研究发现当前数据难以实现真正单细胞单区域染色质状态推断，但通过特征聚合和维度缩减可有效提取细胞类型水平信息。该研究为优化实验方法和计算工具提供了重要理论依据。

　　

随着单细胞测序技术的迅猛发展，单细胞转座酶可及染色质测序（scATAC-seq）已成为研究染色质可及性单细胞分辨率特征的主流技术。该技术通过Tn5转座酶对开放染色质区域进行片段化并添加测序接头，实现对单个细胞染色质状态的解析。然而，scATAC-seq数据面临着前所未有的挑战——超过90%的矩阵条目为零值，这种极端稀疏性使得数据分析变得异常困难。当前的计算方法虽然提供了多种转换流程来提取有意义的信息，但在测序深度归一化、区域特异性偏差处理以及单细胞水平染色质状态解读等关键环节仍存在重大挑战。

为了系统解决这些问题，Aaron Wing Cheung Kwok等研究人员在《Genome Biology》上发表了开创性研究，通过构建分层计数模型深入剖析了scATAC-seq数据分析中的核心难题，并指出了提取更高分辨率信息的机会。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：使用配对插入计数（PIC）方案进行染色质可及性量化；基于10X Genomics多个数据集（包括PBMC10k、造血细胞、LNCaP等）进行实证分析；开发分层贝叶斯模型推断单细胞单区域染色质状态；采用平滑GC-FQ归一化方法处理GC含量偏差；通过模拟研究评估不同参数下的模型性能；利用多组学数据（Multiome）进行正交验证。

Major challenge 1: sequencing depth normalization

研究团队首先深入分析了当前最常用的TF-IDF归一化方法存在的理论缺陷。term frequency（TF）部分相当于单细胞RNA-seq中的CPM归一化，但由于scATAC-seq数据的二值化特性（90-95%的值为0或1），这种归一化反而会引入额外的文库大小信息。inverse document frequency（IDF）部分通过区域均值倒数进行加权，加剧了数据的异方差性。模拟结果显示，TF-IDF不仅无法有效去除文库大小效应，甚至可能放大技术偏差。

Major challenge 2: region-specific bias

研究人员重点考察了GC含量作为区域特异性偏差代表的影响。发现高GC含量区域倾向于具有更高的计数均值，且这种效应在不同重复样本和细胞类型间存在显著差异。通过模拟零假设实验发现，即使在没有真实生物学差异的情况下，区域的log-fold change（LFC）仍然存在与GC含量相关的系统性偏差。令人惊讶的是，针对bulk ATAC-seq设计的平滑GC-FQ归一化方法在单细胞水平效果有限，仅在伪bulk数据上表现良好，这凸显了单细胞数据稀疏性带来的特殊挑战。

Major challenge 3: interpretation of chromatin accessibility at a single-cell, single-region level

研究团队提出了一个创新的分层计数模型来解决上述挑战并推断单细胞单区域染色质状态。该模型包含三个层次：观测计数服从二项分布（反映细胞特异性观测概率）；真实Tn5切割数服从泊松分布（依赖染色质状态开放或关闭）；染色质状态服从伯努利分布。模型通过细胞特异性观测概率p_i、背景速率λ_j^c、信噪比s_j和开放细胞比例π_j等参数，全面捕捉了scATAC-seq数据的生物学和技术过程。

Current scATAC-seq data does not have enough information to infer single-cell, single-region level accessibility state

通过大量模拟实验，研究人员得出了令人惊讶的结论：即使使用真实参数完美恢复，在当前scATAC-seq数据的稀疏性条件下，单细胞单区域染色质状态几乎无法准确识别。最佳情况（λ_j^c=0.02, s_j=100）下的平均AUROC仅为0.84。反直觉的是，低背景速率的情况反而更困难，因为从关闭细胞和开放细胞中采样0计数的概率比接近1，难以区分0值的来源。与真实数据集比较发现，大多数数据集中少于25%的峰值具有足够的计数来支持可靠的染色质状态推断。

Aggregation and dimensionality reduction can serve as intermediate solutions

作为解决方案，研究证明了通过特征聚合和维度缩减可以有效提取生物学信息。将峰值计数按最近基因汇总后应用分层模型，得到的后验概率进行PCA分析，能够捕获生物学变异而不过度依赖测序深度变异。与传统的LSI方法相比，模型后验的第一主成分与文库大小的相关性显著降低（-0.34 vs -0.95），并且在细胞类型识别方面表现出更好的性能。

研究结论强调，虽然scATAC-seq在细胞类型水平的广泛应用不可否认，但将其描述为完全解析单细胞分辨率下的染色质可及性（特别是在单个基因座水平）可能夸大了当前可实现的技术细节。真正的"单细胞"分辨率更多体现在物理层面而非信息层面，由于数据稀疏性，信息分辨率尚未达到理想状态。

讨论部分指出，无论计算方法多么复杂，最终能从scATAC-seq中提取的染色质可及性信息都受到Tn5转座酶插入效率的限制。未来的实验改进应致力于不仅增加信号，还要最小化噪声，以优化信噪比。scTurboATAC等通过优化实验工作流程增强Tn5转座酶灵敏度的技术，代表了正确的发展方向。

这项研究的重要意义在于为scATAC-seq领域提供了严谨的理论框架和实用的分析指南，指出了当前技术的局限性并为未来发展指明了方向。通过建立统计严谨的分层模型和进行系统的模拟研究，研究人员为优化实验设计和计算方法提供了坚实基础，将推动单细胞表观基因组学向更高分辨率发展。