整合生物信息学、血清药物化学与代谢组学揭示当归补血汤通过炎症及NF-κB信号通路调控抗类风湿性关节炎机制

　　本研究通过整合生物信息学、血清药物化学与代谢组学技术，系统揭示了当归补血汤（DBD）通过多组分、多靶点特性抑制NF-κB信号通路活化，降低炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）表达，调控关键代谢途径（丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、精氨酸/脯氨酸代谢等），从而抑制RA-FLS细胞增殖迁移、诱导凋亡，显著缓解CIA大鼠关节炎症状。该研究为DBD治疗类风湿关节炎（RA）提供了分子机制依据和临床转化价值。

　　

引言

类风湿关节炎（RA）是一种以滑膜进行性炎症和后续骨破坏为特征的慢性自身免疫性疾病，全球患病率在0.5%至1.0%之间。当前治疗策略已从传统的非甾体抗炎药（NSAIDs）、糖皮质激素和疾病修饰抗风湿药（DMARDs）扩展到针对特定细胞因子（如肿瘤坏死因子（TNF）-α、环氧化酶（COX）和白介素（IL））的靶向生物制剂。尽管取得了这些进展，现有疗法的临床应用仍然受到不良免疫反应和显著副作用的限制。因此，迫切需要新的补充或替代治疗药物用于RA。

在中医（TCM）中，RA被归类为“痹证”，由正气不足和风、寒、湿、热等致病因素侵入引起，导致气和血流动受阻，经络中形成血瘀。中医已经积累了丰富的抗RA临床经验和有效处方。其中一个方剂是当归补血汤（DBD），这是一个经典的草药处方，由黄芪（Astragalus membranaceus）和当归（Angelica sinensis）以5:1的比例组成。它在中国已有800多年的使用历史。李时珍称黄芪为“补气之王”，强调其大大补充脾肺之气，从而促进血液生成的功能。同时，当归主要以补血、调节血液循环和促进经络流动的作用而闻名。当两者合用，这两味草药在气和血上发挥协同作用，增强血液循环，发挥活血化瘀的效果。DBD已证明具有抗炎作用，并用于治疗炎症、免疫相关疾病以及气和血失衡。它也常用于RA的临床管理，然而，关于DBD在抗RA治疗中的实验研究仍然相对有限，DBD治疗RA的具体化学成分、血吸收成分和现代药理学机制尚未得到充分研究。

近年来，生物信息学、血清药物化学和代谢组学已成为探索中药机制的重要工具。生物信息学通过系统分析分子网络，有助于识别疾病相关靶点和关键信号通路；血清药物化学则深入洞察草药配方的活性成分及其潜在生物活性；代谢组学作为一种高通量分析技术，已广泛应用于生物标志物发现、疾病诊断、机制探索、预后预测、治疗监测和药物开发等领域。然而，这三种技术的整合应用在DBD抗RA背景下尚未得到充分探索，为进一步研究提供了机会。在本研究中，结合生物信息学、血清药物化学和代谢组学，以识别DBD在抗RA中的治疗靶点和通路。我们的发现通过体内和体外实验得到验证，为DBD的临床应用提供了理论基础。

材料与方法

化学品与试剂

黄芪和当归购自宏健药店（长春，中国），该药店还对草药材料进行了鉴定。阳性药物雷公藤多苷片购自上海复旦复华药业有限公司。牛II型胶原（CII）由Chondrex公司提供。完全弗氏佐剂（CFA）由Sigma-Aldrich公司提供。冰乙酸由北京化工厂获得。多聚甲醛由上海源叶生物科技有限公司提供。

成纤维细胞培养基（FM）、成纤维细胞生长补充剂（FGS）、胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素溶液（P/S）购自ScienCell研究实验室。人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）由上海观道生物工程有限公司提供。用于大鼠和人TNF-α、IL-1β和IL-6的ELISA检测试剂盒均购自上海信柏生物科技有限公司。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）购自碧云天生物技术有限公司。总RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。IκBα、p-IκBα、p65、p-p65、IKKα、p-IKKα（批号分别为A16929、AP0707、A19653、AP0944、A2062和AP0505）的抗体购自武汉艾博抗生物技术有限公司，NLRP3（批号30109-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司。

DBD的制备

根据《中国药典》（2020年版）和《药理实验方法学》，人兽等效剂量和体表面积缩放确定DBD的大鼠等效剂量为7.5 g/kg（中剂量），低和高剂量分别设为3.75 g/kg和15.0 g/kg。黄芪和当归（5:1，w/w）在室温下用蒸馏水（1:10，w/v）浸泡30分钟，然后煎煮45分钟。收集滤液，残渣用蒸馏水（1:8，w/v）第二次煎煮45分钟。合并滤液，浓缩制备低（0.375 g/mL）、中（0.75 g/mL）和高（1.5 g/mL）剂量组的溶液。阳性组雷公藤多苷制备为0.945 mg/mL。所有溶液通过灌胃以10 mL/kg给药。

DBD的化学和血吸收成分分析

含药血清的制备

12只雄性Wistar大鼠（180±20 g）由长春益思实验动物技术有限公司提供。所有动物实验方案遵循长春中医药大学动物管理与使用委员会批准的国际动物实验指南（动物伦理批准号2025365）。大鼠在正常光照条件下饲养，室温维持在22°C–25°C。

用于检测血吸收成分的含药血清制备如下：经过适应性喂养期后，使用随机数发生器将动物随机分配到不同组，确保无偏分布。尽可能以单盲方式进行实验以最小化观察者偏差，12只大鼠随机分为正常组和高剂量DBD（DBD-H, 15.0 g/kg）组（每组n=6）。DBD-H组大鼠接受煎剂，正常组大鼠给予蒸馏水，每天固定时间灌胃一次，连续七天。用20%氨基甲酸乙酯麻醉后，从腹主动脉获取血样，通过离心分离血清。然后将同组样本混合均匀，在-80°C保存以备后续分析。

样品制备和UPLC-MS/MS条件

DBD制备为冻干粉用于后续成分分析。适量DBD冻干粉和含药血清与400 μL甲醇混合并涡旋，分别离心，收集上清液，浓缩并干燥。残留物用2-氯-l-苯丙氨酸（4 ppm）重构，并通过0.22 μm膜过滤用于UPLC-MS/MS分析。

液相色谱在40°C的Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱上的Vanquish UHPLC系统上进行，耦合到正负离子模式的Thermo Fisher Q Exactive质谱仪。在正离子模式下，流动相为0.1%甲酸乙腈（B1）和0.1%甲酸水（A1），梯度洗脱程序如下：0–1分钟，8% B1；1–8分钟，8%–98% B1；8–10分钟，98% B1；10–10.1分钟，98%-8% B1；10.1–12分钟，8% B1。在负离子模式下，流动相为乙腈（B2）和5 mM甲酸铵水（A2），梯度洗脱程序如下：0–1分钟，8% B2；1–8分钟，8%–98% B2；8–10分钟，98% B2；10–10.1分钟，98%–8% B2；10.1–12分钟，8% B2。质谱条件：扫描范围：m/z 100–1000，正离子喷雾电压：3.50 kV，负离子喷雾电压：-2.50 kV，鞘气流速：40 arb，辅助气流速：10 arb，毛细管温度：325°C。

DBD抗RA机制的生物信息学探索

RA疾病数据集的获取和处理

从GEO数据库中选择两个基因表达数据集GSE55457和GSE55235。GSE55457数据集包括10名健康个体和13名RA患者滑膜组织的测序数据，而GSE55235数据集包括10名健康个体和10名RA患者。使用R软件中的“SVA”包标准化数据质量并消除矩阵数据的批次效应，从而能够识别RA的治疗靶点。

数据处理和差异表达基因（DEGs）筛选

使用R软件中的“Limma”包从GSE55457和GSE55235数据集中识别DEGs，筛选标准如下：|logFC| ≥ 1, p < 0.05。使用R中的“pheatmap”和“ggplot2”包可视化DEGs。最后，整合两个数据集的数据，对健康个体和RA患者滑膜组织中的DEGs进行主成分分析（PCA）分析。生成DEGs的火山图和热图。

DEGs的富集分析

基于之前的DEGs，使用R软件中的“GenetrProfile”包进行基因本体（GO）分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析和基因集富集分析（GSEA）。选择前15个富集术语并可视化输出。

DEGs的免疫浸润细胞分析

基于DEGs数据矩阵分析结果，使用R软件中的“X cell”包分析DEGs的免疫浸润，并比较不同组间67种免疫细胞的表达差异。使用R软件中的“ggplot2”包绘制箱线图可视化分析结果。

DBD血吸收成分的药物靶点获取

为了分析DBD的靶点，使用了PubChem、Swiss ADME和Swiss Target Prediction。从PubChem获取SDF或SMILES格式的结构数据用于标准化建模。Swiss ADME用于筛选具有良好药代动力学的成分（具有高GI吸收、符合Lipinski、Veber和Egan规则，且生物利用度评分≥0.55的成分）。通过Swiss Target Prediction识别预测概率>0的靶点用于进一步分析。

枢纽基因的富集分析

将第2.4.2节中识别的RA的DEGs与第2.4.5节中识别的DBD药物靶点交叉参考，获得重叠基因，这些基因被认可为DBD抗RA的枢纽基因。对枢纽基因进行GO和KEGG富集分析。选择前15个富集术语并可视化输出。

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

使用STRING数据库中的“Multiple Proteins”功能为枢纽基因构建PPI网络，指定“Homo sapiens”为目标生物。

DBD抗RA机制的体外研究

含药血清的制备、细胞分组和干预

用于细胞干预的DBD含药血清制备如下：使用随机数发生器进行随机化，将动物分配到不同组，确保无偏分布。尽可能以单盲方式进行实验以最小化观察者偏差。36只Wistar大鼠随机分为5组。正常组12只大鼠给予等体积蒸馏水，其血清用于干预正常组和模型组的细胞（正常组n=12）。其余24只大鼠随机分为4组，给予阳性药物或不同剂量的DBD（DBD低剂量：3.75 g/kg，DBD中剂量：7.5 g/kg，DBD高剂量：15.0 g/kg）（阳性组和不同剂量DBD组每组n=6）。连续灌胃7天后，使用上述方法收集血清，然后在56°C灭活，并在-20°C保存以备后用。

RA-FLS细胞在37°C、5% CO?和95%空气的条件下，在添加10% FBS、FGS和P/S溶液的FM培养基中培养。然后将RA-FLS细胞随机分为以下6组：正常组（基础培养基+10%正常组大鼠血清培养基）、模型组（20 ng/mL TNF-α + 10%正常组大鼠血清培养基）、阳性组（20 ng/mL TNF-α + 10%阳性组血清培养基）、DBD低剂量组（20 ng/mL TNF-α + 10% DBD低剂量组大鼠血清培养基，DBD-L）、DBD中剂量组（20 ng/mL TNF-α + 10% DBD中剂量组大鼠血清培养基，DBD-M）和DBD高剂量组（20 ng/mL TNF-α + 10% DBD高剂量组大鼠血清培养基，DBD-H）。

细胞增殖 assay

使用CCK-8 assay评估RA-FLS细胞增殖。将100 μL细胞悬液（5×103细胞/孔）接种在96孔板中，在37°C孵育24小时，并用TNF-α（20 ng/mL）刺激1小时。然后用不同组的含药血清处理细胞24或48小时。加入10 μL CCK-8溶液并孵育3小时后，测量450 nm处的吸光度以计算细胞增殖抑制率。

炎症因子

通过ELISA测量RA-FLS细胞中的炎症因子水平。将RA-FLS细胞（2.5×10?细胞/孔）接种在6孔板中，在37°C孵育12小时。用TNF-α（20 ng/mL）刺激1小时并用含药血清处理24小时后，收集上清液，并按照ELISA试剂盒方案测定TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

细胞迁移的Transwell assay和划痕 assay

使用Transwell assay评估DBD对RA-FLS细胞垂直迁移的影响。用TNF-α（20 ng/mL）刺激RA-FLS细胞1小时，然后用含药血清处理24小时。将细胞重悬于无血清培养基中（5×10?细胞/mL），并将200 μL悬液加入上室。下室包含500 μL含10% FBS作为化学引诱剂的培养基。24小时后，用4%多聚甲醛固定迁移细胞20分钟，用0.1%结晶紫染色20分钟，随机选择五个视野，并通过Image J软件计算平均细胞数。

划痕伤口愈合assay评估了RA-FLS细胞的横向迁移。将RA-FLS细胞接种在6孔板中（4.5×10?/孔），当细胞达到>95%汇合度时，将它们无血清饥饿12小时以减少增殖效应。使用移液器吸头创建三个划痕，与预先绘制的3条线形成九个交叉点，并用PBS洗去脱落的细胞。然后用TNF-α（20 ng/mL）和不同的含药血清处理细胞。在显微镜下在0、12和24小时拍摄图像，并使用Image J软件分析划痕区域。

Hochest 33342染色细胞凋亡和线粒体膜电位（MMP）检测

通过hochest 33342染色观察凋亡。将RA-FLS细胞（2×10⁵细胞/孔）接种在6孔板中，细胞贴壁后用TNF-α（20 ng/mL）孵育1小时，并用含药血清处理24小时。去除培养基后，每孔加入1 mL hochest 33342染色溶液，在37°C孵育30分钟。孵育后，丢弃染色溶液，并用PBS洗涤细胞三次。随后进行荧光检测以观察核碎裂状态。

MMP也是用于早期凋亡检测的有用指标。如前所述，用TNF-α和含药血清处理RA-FLS细胞（1×10?细胞/孔）。孵育后，去除培养基并用PBS洗涤细胞。加入新鲜培养基（1 mL）和JC-1染色工作溶液（1 mL），随后在37°C孵育。然后用JC-1染色缓冲液洗涤细胞两次，并在荧光显微镜下观察凋亡。

DBD抗RA机制的体内研究

胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型的建立和DBD治疗

经过1周的适应性喂养后，使用48只雄性Wistar大鼠（SPF, 180±20 g）。使用随机数发生器进行随机化，将动物分配到不同组，确保无偏分布。尽可能以单盲方式进行实验以最小化观察者偏差，随机选择40只用于建立CIA模型。通过将10 mg胶原粉与5 mL乙酸混合，静置过夜，然后与等体积的完全弗氏佐剂涡旋制备牛II型胶原乳液。40只大鼠在足部注射0.15 mL乳液进行初次免疫，1周后在同一部位注射0.10 mL加强注射。初次免疫后2周，将大鼠随机分为6组（每组n=8）：正常（非建模）、模型、阳性（雷公藤多苷）、DBD低剂量（3.75 g/kg, DBD-L）、DBD中剂量（7.50 g/kg, DBD-M）、DBD高剂量（15.0 g/kg, DBD-H）。正常组和模型组给予蒸馏水，而治疗组给予阳性药物或不同剂量的DBD。连续灌胃28天后，根据后续分析收集血清、脾脏、胸腺和踝关节。根据以下标准评估关节炎严重程度：（0）无肿胀或红斑；（1）局部趾关节受影响；（2）局部趾关节和足背受影响；（3）整个爪受影响（包括踝关节）；（4）最大红斑、肿胀和运动功能障碍。所有4肢的总分，最高分为16分，用于评估关节炎严重程度。

血清中炎症因子的测量

根据相关说明，使用ELISA试剂盒测量促炎细胞因子，包括TNF-α、IL-1β和IL-6。

苏木精-伊红（HE）染色

使用HE染色评估大鼠踝关节的病理变化。将保存的关节从4%多聚甲醛溶液中取出，并用EDTA脱钙适当时间。经过二甲苯梯度脱蜡和乙醇脱水后，将组织包埋在石蜡中。制备约5 μM厚的切片，在60°C烘烤1小时，随后进行HE染色。在NIKON Ci-S光学显微镜下观察关节的病理变化。此外，根据先前报道的参考文献评估组织病理学评分，主要评估参数如炎症细胞浸润和血管翳形成等。

Micro-CT扫描检查

使用PerkinElmer Quantum GX micro CT系统进行Micro-CT扫描，获取CIA大鼠的3D重建图像，使用PerkinElmer Analyze软件。简要来说，用4%多聚甲醛固定的保存踝关节组织通过micro-CT扫描，扫描参数如下：X射线：90 kv和88 μA，视野（FOV）：72 mm，采集：72，重建：36，体素大小：72 μM，扫描模式：高分辨率，扫描时间：4分钟。

代谢组学分析

血清样品制备

将血清样品在4°C解冻，随后与等体积的预冷甲醇/乙腈/水（2:2:1, v/v）混合。将混合物涡旋并进行低温超声处理30分钟。然后在4°C以14,000 g离心20分钟。收集上清液并真空干燥。然后将残留物在100 μL乙腈/水（1:1, v/v）中重构，涡旋，并在4°C以14,000 g再次离心15分钟。最终上清液用于进一步分析。

UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS/MS分析

使用UHPLC（Vanquish UHPLC, Thermo）系统与Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱（1.7 μM, 2.1 mm × 100 mm）耦合Orbitrap（Q Exactive HF-X/Q Exactive HF）在上海个人生物技术有限公司进行分析。流动相由25 mM乙酸铵和25 mM氢氧化铵水溶液（A相）和乙腈（B相）组成。梯度为98% B持续1.5分钟，在10.5分钟内线性减少至2%，然后保持2分钟，然后在0.1分钟内增加至98%，采用3分钟重新平衡期。柱温：25°C，体积流速：0.25 mL/min；进样体积：2 μL。

使用ESI正负离子模式。ESl源条件设置如下：离子源气体1（Gas1）：60，离子源气体2（Gas2）：60，帘气（CUR）：30，源温度：600°C，离子喷雾电压浮动（ISVF）：±5500 V。在MS和自动MS/MS采集中，仪器设置为在m/z范围80–1200 Da和70–1200 Da内采集。

数据分析

使用ProteoWizard MSConvert将原始MS数据转换为MzXML文件。使用XCMS进行峰检测、对齐和分组，生成每个样品的m/z比、保留时间和峰强度表。基于精确m/z值和MS/MS谱图进行代谢物鉴定，与内部真实标准数据库进行比较。经过总和归一化和pareto缩放后，使用R包（ropls）分析代谢组学的多维统计分析数据，包括多变量分析技术如PCA和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。通过七折交叉验证和排列测试评估模型稳健性。计算OPLS-DA模型中的变量重要性投影（VIP）值以确定每个变量对分类的贡献。使用学生t检验评估统计显著性，如果VIP > 1且p < 0.05，则代谢物被识别为显著，并使用MetaboAnalyst 5.0进行差异代谢物通路分析。

Western Blot分析

根据先前方法刺激和处理RA-FLS细胞（5×10⁵细胞/孔）。使用含有1%蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取RA-FLS细胞和滑膜组织的总蛋白，并使用BCA蛋白定量试剂盒测量蛋白浓度。通过10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离总蛋白，并转移到0.22 μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭1.5小时，随后在4°C与针对β-肌动蛋白、IκBα、p-IκBα、p65、p-p65、IKKα、p-IKKα和NLRP3的特异性一抗孵育过夜。用PBS洗涤后，将膜在室温下与二抗孵育1小时。使用ImageJ软件量化图像。所有实验重复三次。

实时聚合酶链反应（RT-PCR）分析

刺激和干预后，使用RNAsimple总RNA试剂盒提取RA-FLS细胞（4.5×10?细胞/孔）以及已称重和研磨的滑膜组织中的总RNA。随后根据TRANS反转录试剂盒的说明合成cDNA。随后，通过组合2× Hieff PCR Master Mix、cDNA模板、引物和水制备50 μL反应混合物。然后进行RT-PCR扩增以获得Ct值。使用2^?ΔΔCt方法量化和标准化每个基因的相对表达。用于RT-PCR分析的引物如表1所示。所有实验重复三次。

统计分析

数据表示为平均值±标准差（SD）。应用单因素方差分析（ANOVA）确定对照组和模型组、模型组和治疗组结果之间的统计显著性。p < 0.05被认为具有统计显著性。所有数据使用Prism 9.5（GraphPad Software, San Diego, CA, United States）进行分析。

结果

生物信息学分析

基因表达数据合并和RA的DEGs筛选

纠正了两个数据集之间的批次效应，并标准化了表达水平，使它们能够整合到一个统一的数据集中。PCA揭示了健康对照组（HC）和RA患者组之间基因表达模式的清晰分离。DEGs分析筛选出316个显著上调基因和225个显著下调基因（|logFC| ≥ 1, p < 0.05），并使用火山图和热图进行可视化。

DEGs的富集分析

GO分析结果显示，白细胞活化正调控和T细胞活化调控是主要的生物过程（BP）。在细胞组分（CC）中，DEGs主要分布在质膜外侧和含胶原的细胞外基质中。在分子功能（MF）中，与糖胺聚糖结合和免疫受体活性相关的功能显著富集。KEGG分析显示，DEGs显著富集于趋化因子信号通路、NF-κB信号通路和IL-17信号通路，表明DEGs在炎症反应和免疫调控中发挥重要作用。此外，使用GSEA中的GSE55457和GSE55235数据集确认了RA与适应性免疫反应、免疫反应激活信号通路、细胞粘附分子和吞噬体之间的密切关联。

免疫细胞浸润分析

免疫细胞浸润分析显示，健康对照组（HC）和RA组之间有32种免疫细胞存在显著差异（p < 0.05）。结果显示，RA患者滑膜组织中CD8⁺ T细胞、记忆B细胞、B细胞等的水平显著上调，而脂肪细胞、成纤维细胞、NKT细胞等的水平显著下调。

DBD的靶点筛选和成分鉴定

系统鉴定了DBD的化学和血吸收成分。化学分析使用UPLC-MS/MS在正负离子模式下（ppm < 5）揭示了83种成分，如基峰色谱图（BPC）所示。在排除空白血清中存在的内源性物质后，在相同分析条件下鉴定了34种血吸收成分（ppm < 5），相应的BPC如图所示。基于这34种血吸收成分，在去除重复后预测了总共503个DBD的潜在治疗靶点。

枢纽基因的识别和PPI网络的构建

DBD靶点与RA中DEGs之间的交叉基因被识别为对DBD抗RA作用至关重要的枢纽基因。总共在此分析中识别出40个枢纽基因。这些枢纽基因随后被上传到STRING数据库以构建PPI网络。根据它们的度值列出了前10个枢纽基因。

枢纽基因的富集分析

对40个枢纽基因进行了GO和KEGG分析。GO分析揭示了这些基因在三个类别中的功能分布：BP、CC和MF。KEGG富集分析显示，药物靶点显著富集于炎症相关通路，包括IL-17、NF-κB和TNF信号通路。鉴于其作为各种炎症相关疾病核心的经典促炎通路的作用，并根据RA中DEGs的KEGG分析，选择NF-κB信号通路作为进一步研究和验证的重点。

DBD对RA的体外研究结果

DBD抑制RA-FLS细胞的增殖

模型组的OD值显著高于正常组（p < 0.01）。DBD含药血清以剂量依赖的方式降低OD值（p < 0.01），与阳性组相似。定量分析证实，DBD以浓度和时间依赖的方式抑制TNF-α刺激的RA-FLS增殖，在DBD-H组中观察到最强的效果，与阳性组相当。

DBD抑制炎症因子的释放

通过测量细胞培养上清液中的炎症因子评估了DBD含药血清的抗炎效果。模型组中IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著增加（p < 0.01），而含药血清处理显著降低了这些炎症因子的水平。这些结果表明DBD有效抑制炎症反应。

DBD抑制RA-FLS细胞的迁移

评估了RA-FLS细胞的迁移能力。TNF-α刺激显著增强了RA-FLS细胞的数量及其穿过 permeable 膜的能力。用DBD含药血清处理显著降低了TNF-α诱导的