CDK9抑制剂AZD4573通过下调c-MYC和MCL-1增强维奈托克联合阿扎胞苷对阿糖胞苷耐药AML的细胞死亡作用

　　本研究揭示了CDK9抑制剂AZD4573通过协同下调关键生存蛋白c-MYC和MCL-1，显著增强维奈托克(VEN)联合阿扎胞苷(AZA)对阿糖胞苷(AraC)耐药急性髓系白血病(AML)细胞的杀伤效应，为克服临床耐药难题提供了创新性的三重联合治疗策略。

　　

3.1 mTOR、c-MYC和MCL-1在阿糖胞苷耐药AML细胞存活中的作用

研究团队通过基因集富集分析发现，在阿糖胞苷耐药的MV4-11/AraC-R细胞中，mTORC1信号通路显著激活。Western blot结果显示，与亲本细胞系相比，耐药细胞系中磷酸化S6(p-S6)蛋白水平明显升高，患者来源异种移植(PDX)细胞也表现出类似的p-S6水平，表明阿糖胞苷耐药细胞中mTOR活性相对增强。

实验表明，c-MYC抑制剂10058-F4处理可降低c-MYC蛋白水平并诱导AML细胞死亡，但效果在不同细胞系间存在差异（<20%至约50%）。MCL-1抑制剂AZD5991处理增加了MCL-1水平，仅引起轻微的细胞死亡。mTOR抑制剂雷帕霉素处理可下调p-S6水平，但未检测到显著的AML细胞死亡诱导。

值得注意的是，虽然单独靶向c-MYC、MCL-1或mTORC1仅引起最小的细胞死亡，但AZD5991与10058-F4联合处理，或10058-F4与雷帕霉素联合处理能显著诱导AML细胞死亡。更重要的是，三种抑制剂同时处理比任何两药组合或单药治疗都能引起更显著的AML细胞死亡，表明同时靶向c-MYC、MCL-1和mTOR可能是针对阿糖胞苷耐药AML细胞的有前景策略。

3.2 AZD4573下调阿糖胞苷耐药AML细胞中的c-MYC、MCL-1和p-S6并诱导细胞死亡

CDK9在Mcl-1和c-MYC的转录过程中起关键作用。AZD4573作为一种新型CDK9抑制剂，在AML细胞中显示出良好的活性。实验发现，AZD4573处理可增加切割型 caspase 3水平，并下调阿糖胞苷获得性耐药细胞中的c-MYC、MCL-1和p-S6。

在使用泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK处理后，c-MYC、MCL-1和p-S6的下调未能被挽救，证明这种下调不是caspase激活的结果。AZD4573处理可浓度依赖性地诱导THP-1细胞死亡，对多种细胞系的EC₅₀在12.5至24.4 nM之间，原代患者样本的EC₅₀在33.9至95.4 nM之间。

重要的是，正常人脐带血细胞经AZD4573处理后未显示明显的caspase 3切割增加，也未检测到c-MYC或p-S6。虽然MCL-1蛋白水平有所下降，但缺乏caspase 3切割增加和最小的细胞死亡诱导表明存在潜在的治疗窗口。

c-MYC和MCL-1的相对转录水平随着AZD4573浓度的增加而降低，且c-MYC和MCL-1蛋白半衰期不受AZD4573处理影响。虽然CDK9曾被报道与mTOR复合物支架蛋白mLST8结合并通过S6磷酸化控制mRNA翻译，但免疫共沉淀实验显示AZD4573处理对CDK9与mLST8的结合没有明显影响。这些结果表明c-MYC和MCL-1的下调是由于转录调控，而p-S6的抑制并非由于CDK9与mTORC1复合物的解离。

3.3 AZD4573增强VEN+AZA对阿糖胞苷耐药AML细胞的抗白血病活性

c-MYC和MCL-1的下调已被证明可增强VEN以及VEN+AZA的活性。实验发现AZD4573与VEN协同诱导阿糖胞苷耐药AML细胞系和原代患者样本的细胞死亡。

由于c-MYC的降低已被证明可增强AZA的抗白血病活性，研究团队用AZA+AZD4573处理阿糖胞苷耐药细胞，结果显示协同诱导细胞死亡。重要的是，虽然AZD4573与VEN在正常脐带血细胞中具有协同作用，但其程度远低于在AML细胞中。此外，AZD4573和AZA的组合在这些正常血细胞中显示出拮抗作用(CI>1.0)。

AZD4573和VEN处理正常人脐带血细胞后，CFU-E（红系集落形成单位）和CFU-GEMM（粒细胞、红细胞、巨噬细胞、巨核细胞集落形成单位）有轻微但显著的减少，而AZD4573和AZA处理的细胞集落数没有显著减少。

研究团队随后在两种相对耐VEN的阿糖胞苷耐药AML细胞系中测试了AZD4573、VEN和AZA的三药组合。三药组合相比单药和两药组合能显著诱导细胞死亡。将VEN和AZA浓度降低10倍后，与匹配的单药治疗相比仍能显著诱导细胞死亡，但三药组合的程度明显较低。

有趣的是，将VEN降低10倍(100 nM)但不降低AZA，能产生相似水平的细胞死亡(THP-1细胞为85.4%对86.5%，U937/AraC-R细胞为83.3%对88.4%)。在相对对VEN敏感的MV4-11/AraC-R中，三药组合相比所有两药组合显示细胞死亡显著增加。

三药组合还能显著增加来自新诊断和复发AML患者的原代AML患者样本以及复发AML患者PDX细胞的细胞死亡。Annexin V阳性诱导伴随着caspase 3的切割，表明细胞凋亡的诱导。集落形成实验显示，在5个患者样本中的4个中，单药和两药处理的集落数相比对照显著减少。

重要的是，对人脐带血细胞的处理仅引起最小的细胞死亡诱导，并且不影响集落形成，表明存在潜在的治疗窗口。

3.4 AZD4573下调c-MYC和MCL-1增强VEN+AZA诱导的AML细胞死亡

研究人员接下来确定了VEN、AZA和AZD4573单独及联合使用对c-MYC、MCL-1和p-S6蛋白水平的影响。单独使用VEN处理(24小时)在MV4-11/AraC-R和AML#276细胞中基本不改变MCL-1水平，但在THP-1中增加，这与先前报道一致。

使用AZA处理24小时导致p-S6降低，当VEN加入治疗后这种降低得以维持。VEN+AZA处理降低了MV4-11/AraC-R和AML#276中的c-MYC、MCL-1和p-S6，以及THP-1中的c-MYC和p-S6。AZD4573处理显著降低了细胞系中的c-MYC、MCL-1和p-S6，而在AML#276中仅c-MYC和MCL-1降低。

AZD4573与VEN或AZA联合使用显示与单独AZD4573处理相比，c-MYC、MCL-1和p-S6的降低相似或略多。三药组合处理导致极少或没有检测到c-MYC、MCL-1和p-S6。

为确定这些蛋白的下调是否发生在细胞死亡之前，研究人员用更短时间处理THP-1细胞并检测蛋白水平变化和annexin V阳性。AZD4573与VEN、AZA或VEN+AZA组合在治疗2小时后降低MCL-1水平，这发生在细胞死亡诱导之前。

AZA处理3小时导致c-MYC水平降低，加入VEN后这种降低得以维持，且发生在细胞死亡诱导之前。AZD4573和AZA联合处理3小时降低了c-MYC、MCL-1和p-S6，发生在细胞死亡诱导之前。AZD4573与VEN或VEN+AZA组合在治疗3小时后相比单独AZA显著降低c-MYC、MCL-1和p-S6，并伴有显著的细胞死亡诱导，尽管幅度较小(24.7% annexin V阳性)。

在MV4-11/AraC-R细胞中，1小时处理对任何药物处理的c-MYC、MCL-1或p-S6都没有显著影响。2小时后，AZA降低了c-MYC水平，而与VEN联合使用时则下调了c-MYC和p-S6。AZD4573+VEN处理(2小时)下调了c-MYC和p-S6。AZD4573+AZA处理(2小时)降低了c-MYC、MCL-1和p-S6。AZD4573与VEN+AZA组合显示与AZD4573+AZA处理相似的下调效果，但相比单独AZA更为明显。

为确定AZD4573下调MCL-1和c-MYC是否在增强VEN+AZA诱导的细胞死亡中起重要作用，研究人员在THP-1细胞中进行敲低实验。MCL-1或c-MYC的敲低显著增强了VEN、AZA和VEN+AZA诱导的细胞死亡。然而，mTOR抑制对VEN、AZA或VEN+AZA诱导的细胞死亡没有显著影响。

Bax/Bak双敲低显著减少了VEN、AZA、VEN+AZA、AZD4573、AZD4573+VEN、AZD4573+AZA和AZD4573+VEN+AZA诱导的细胞死亡，证明这些药物至少部分通过诱导内在凋亡途径引起细胞死亡。

3.5 线粒体代谢下调在AZD4573+维奈托克+阿扎胞苷诱导的AML细胞死亡中的作用

c-MYC是氧化磷酸化和糖酵解的重要调节因子。研究人员测量了AZD4573单独及与VEN+AZA联合使用对氧消耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)的影响，这两项指标分别指示OXPHOS和糖酵解。

三药组合在仅处理1小时后就能显著降低MV4-11/AraC-R细胞的基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸容量和ATP关联呼吸。在THP-1细胞中也获得了类似结果，尽管细胞处理时间为2小时。

在MV4-11/AraC-R细胞中，AZD4573处理显著降低了基础ECAR，而VEN+AZA处理显著增加了基础ECAR，加入AZD4573使基础ECAR水平恢复到基线。在THP-1细胞中，AZD4573处理显著降低基础ECAR，VEN+AZA对基础ECAR没有显著影响，三药组合将基础ECAR降低到与单独AZD4573处理相似的水平。

为评估AZD4573抑制OXPHOS在VEN+AZA诱导细胞死亡中的作用，研究人员用线粒体复合物1抑制剂IACS-010759单独及与VEN+AZA联合处理MV4-11/AraC-R和THP-1细胞。IACS-010759显著增强了VEN+AZA诱导的细胞死亡，尽管增强程度很小。糖酵解抑制剂2-DG处理显著增强了VEN+AZA诱导的细胞死亡。这些结果表明，AZD4573抑制OXPHOS和糖酵解也有助于VEN+AZA在阿糖胞苷耐药AML中诱导细胞死亡，尽管程度较小。

4 讨论

本研究显示，选择性CDK9抑制剂AZD4573增强了VEN、AZA和VEN+AZA对具有固有或获得性阿糖胞苷耐药性的AML细胞的体外抗白血病活性，且不伤害正常造血细胞。另一种CDK9抑制剂LDC000067也能增强VEN、AZA和VEN+AZA对阿糖胞苷耐药AML细胞的体外抗白血病活性。

这些结果与CDK9抑制和VEN之间协同抗白血病活性的报道一致。更重要的是，这些结果建立在先前发现的基础上，表明AZD4573与VEN+AZA协同对抗阿糖胞苷耐药AML细胞，提示该组合可能对化疗后R/R AML显示疗效。

一个有趣的发现是AZD4573处理还能下调c-MYC并增强VEN+AZA诱导的AML细胞死亡。先前的研究表明，c-MYC抑制能显著降低阿糖胞苷耐药AML细胞中的OXPHOS和糖酵解。本研究结果也显示基础糖酵解显著降低，尽管AZD4573处理仅在两个测试细胞系中的一个中显著降低OXPHOS。

虽然线粒体复合物I和糖酵解的抑制显著增强了VEN+AZA诱导的AML细胞死亡，但相比VEN+AZA的增强程度很小，表明在针对大量AML细胞的机制中作用较小。然而，研究人员推测OXPHOS抑制可能在针对化疗耐药和持久性细胞的抗白血病活性中起更实质性的作用，因为这些细胞据报道依赖OXPHOS生存。

最近有报道称，在新诊断的接受VEN+AZA联合治疗的AML患者中，减少VEN剂量和持续时间能保持相似的反应和总生存期。体外研究表明，降低VEN浓度在阿糖胞苷耐药AML细胞系中能由VEN+AZA组合产生相似水平的细胞死亡。此外，研究结果表明当与AZD4573+AZA联合使用时，减少VEN用量也可能被考虑，支持进一步的临床前研究以确定三药组合的体内疗效和VEN的潜在剂量减少。

5 结论

总之，AZD4573与VEN+AZA联合使用对阿糖胞苷耐药的AML细胞显示出有前景的体外抗白血病活性。虽然需要体内数据来支持进一步开发，但一项2a期临床试验的中期结果表明，将CDK9抑制剂(SLS009)与VEN+AZA组合的策略在对VEN为基础组合耐药的R/R AML患者中是安全可行的。这些结果支持进一步研究AZD4573与VEN+AZA联合治疗阿糖胞苷耐药AML，尽管需要进行临床前体内研究以确定疗效和解决毒性问题。