靶向线粒体DNA复制的三苯基膦共轭喹诺酮抗生素的抗癌效应研究

　　本研究创新性地将线粒体靶向分子三苯基膦（TPP）与喹诺酮抗生素（NA和CFX）共轭连接，成功合成新型化合物MitoQNs。这些衍生物显著降低了抗菌活性，但通过增强线粒体递送效率，有效抑制癌细胞线粒体DNA（mtDNA）复制，诱导mtROS生成和线粒体自噬，最终引发癌细胞特异性坏死样死亡。体内实验证实其显著抑制肿瘤生长且安全性良好，为开发低耐药性、高抗癌活性的靶向抗癌药物提供了新策略。

　　

ABSTRACT

抗菌喹诺酮类药物广泛用于治疗人类细菌感染，通过抑制细菌DNA旋转酶和拓扑异构酶IV发挥作用。哺乳动物线粒体中存在类似酶类，喹诺酮可通过抑制线粒体拓扑异构酶，导致线粒体DNA（mtDNA）复制抑制和癌细胞死亡。然而，诱导癌细胞死亡需要高浓度喹诺酮，可能与线粒体递送效率低有关。本研究合成了与线粒体靶向分子三苯基膦（TPP）共轭的萘啶酸（NA）和环丙沙星（CFX），即NX–TPP和CFX–TPP，以增强线粒体递送并评估其抗癌功效。NX–TPP和CFX–TPP显著降低了抗菌活性，但两者在结肠HT-29、胰腺MIAPaCa-2和其他癌细胞中显著诱导细胞死亡，而在正常皮肤成纤维细胞和人血管内皮细胞等非癌细胞中无此效应。NX–TPP诱导 characterized by细胞膜气球样变和破裂的坏死样细胞死亡。机制上，NX–TPP有效进入线粒体，导致线粒体活性氧（mtROS）生成增加、线粒体自噬增强，以及mtDNA拷贝数和线粒体呼吸减少。NX–TPP在HT-29和MIAPaCa-2异种移植小鼠模型中抑制肿瘤生长，且无任何明显不良反应。这些结果表明，靶向mtDNA复制的喹诺酮衍生物（称为MitoQNs）具有降低的抗菌活性（从而减少抗生素耐药性诱导）和增强的抗癌功效，是癌症治疗的候选药物。

Abbreviations

ATP：腺苷三磷酸；CFX：环丙沙星；HDFs：人皮肤成纤维细胞；HUVECs：人脐静脉内皮细胞；MitoQN：Mitoquinolone；MLKL：混合谱系激酶域样假激酶；mtDNA：线粒体DNA；mtROS：线粒体活性氧；NA：萘啶酸；OCR：耗氧率；RIPK1：受体相互作用蛋白激酶1；RIPK3：受体相互作用蛋白激酶3；TPP：三苯基膦

1 Introduction

线粒体是真核细胞中主要负责产生代谢能量的细胞器，并参与众多细胞过程。它们通常被认为起源于被真核祖细胞吞噬的ɑ-变形菌。在原核细胞中，细菌II型拓扑异构酶、DNA旋转酶和拓扑异构酶IV在调节关键DNA拓扑结构所需的超螺旋中发挥重要作用。因此，线粒体拥有自己的小型环状基因组，即所谓的线粒体DNA（mtDNA），以及类似的II型拓扑异构酶以维持mtDNA构象并进行mtDNA复制。这种相似性使得线粒体易受抑制细菌II型拓扑异构酶的抗生素的影响，并且此类抗生素的抗癌作用已被研究。其中之一是喹诺酮类，一组广谱抗菌剂。

喹诺酮通常用作人类和兽药治疗细菌感染。第一代喹诺酮萘啶酸（NA）对革兰氏阴性菌具有抗菌活性，于1962年发现。第二代氟喹诺酮类以环丙沙星（CFX）为代表，于1980年代开发，对革兰氏阳性菌的活性有所改善。它们通过非共价结合在酶-DNA界面上的DNA旋转酶和拓扑异构酶IV来抑制细菌中的DNA合成。相反，NA和氟喹诺酮对人类拓扑异构酶IIα和IIβ的抑制活性有限，后者是包括依托泊苷和多柔比星在内的抗癌剂的已知靶点。

除抗菌特性外，NA和CFX对肿瘤细胞具有抑制和/或细胞毒性作用，包括小鼠白血病和黑色素瘤细胞、人结肠癌细胞系、HepG2肝癌细胞、A549肺癌细胞、T24膀胱癌细胞和MG-63骨肉瘤细胞。然而，在所有情况下，即使对敏感癌细胞，也需要相当高浓度的化合物（0.3–3 mM，取决于癌细胞类型）来抑制存活，这可能限制其在临床环境中治疗各种类型癌症的使用。这可能归因于药物进入、外排和线粒体递送。

抗生素无疑有助于预防感染和减少传染病相关并发症，但其不当使用（过度使用和/或误用）面临抗生素耐药性的风险，这对患有传染病的患者是危险的。这对喹诺酮类也是如此，事实上，氟喹诺酮通过选择压力诱导细菌喹诺酮耐药性，通过改变DNA旋转酶和拓扑异构酶IV酶以及药物进入和外排的变化。此外，最近有研究表明，使用包括喹诺酮在内的抗生素与随后通过改变肠道微生物群组成而增加结肠息肉和癌症的风险之间存在关联。这些问题可能会影响高剂量喹诺酮在癌症患者长期治疗中的临床使用。解决这些问题的方法之一可能是通过改善线粒体递送同时降低抗菌活性来增强喹诺酮的抗癌作用；然而，这在实践中可能具有挑战性。

三苯基膦（TPP）被广泛认为是线粒体靶向部分。由于线粒体的高负膜电位，TPP可以迅速穿过膜并有效在线粒体中积累。先前的研究表明，TPP修饰可有效改善感兴趣化合物在癌细胞中线粒体的递送。在这项研究中，我们设计并合成了通过将TPP与NA和CFX连接而成的TPP共轭喹诺酮衍生物[以下称为Mitoquinolones（MitoQNs）]，并评估了它们的抗菌活性和抗癌功效 in vitro和in vivo。我们的结果表明MitoQNs具有 promising潜力，与亲本喹诺酮相比，似乎具有降低的抗菌活性但增强的抗癌活性。

2 Material and Methods

实验程序包括MitoQN合成、大肠杆菌DNA旋转酶测定、细菌培养、细胞培养、细胞存活测定、逆转录定量聚合酶链反应、线粒体功能分析、免疫印迹、免疫细胞化学、免疫组织化学和动物实验。详细信息见Document S1。

3 Results

3.1 MitoQN Synthesis

我们合成了TPP共轭的NA和CFX衍生物（Document S1, Figures S1和S2）。TPP部分与NA的C3-羧酸基团（NX–TPP）和CFX的C7-哌嗪基团（CFX–TPP-1）或C3-羧酸基团（CFX–TPP-2）共轭连接（Figure 1），这些位点常用于喹诺酮的化学修饰。

3.2 Inhibitory Effect of the MitoQNs on E. coli DNA Gyrase Activity

我们比较了NA和NX–TPP与CFX、CFX–TPP-1和CFX–TPP-2的DNA旋转酶抑制活性。DNA旋转酶活性抑制通过琼脂糖凝胶电泳图像上超螺旋DNA量的减少来确认。结果显示，pHOT1松弛DNA与大肠杆菌DNA旋转酶孵育导致DNA超螺旋化（Figure 2A–C, lanes 1和3）。超过100 μM NA抑制DNA旋转酶活性，而高于500 μM NX–TPP达到与NA几乎相同的抑制水平（Figure 2A）。相反，高于1 μM CFX抑制DNA旋转酶活性，表明其抑制活性比NA强约100倍（Figure 2B,C）。然而，CFX–TPP-1和CFX–TPP-2均显示出比CFX弱约10倍的活性，与TPP共轭位置无关（Figure 2B,C）。这些结果表明，TPP共轭显著减弱了NA和CFX的DNA旋转酶抑制活性，而CFX–TPP-1和CFX–TPP-2均比NX–TPP活性更强。

3.3 Effect of the MitoQNs on Antibacterial Activity

为了研究NX–TPP、CFX–TPP-1和CFX–TPP-2的抗菌活性，我们检查了它们对大肠杆菌DH5α生长的影响。正如预期，TPP与NA和CFX共轭显著降低了抗菌活性。约430 μM NA和0.7 μM CFX抑制DH5α生长，而NX–TPP、CFX–TPP-1和CFX–TPP-2在等效浓度下没有抑制（Figure 2D）。CFX–TPP-1和CFX–TPP-2表现出可比抗菌活性所需的浓度（分别约50和100 μM）远高于CFX浓度（Figure S3）。

3.4 Effect of the MitoQNs on Cancer Cell Growth

接下来，我们检查了NX–TPP、CFX–TPP-1和CFX–TPP-2对HT-29细胞和MIAPaCa-2细胞生长的影响。NA轻微抑制癌细胞系生长，而CFX在较高浓度下显著抑制生长。令人惊讶的是，所有化合物在几乎相当的浓度下均剂量依赖性地显著抑制HT-29和MIAPaCa-2细胞系生长，除了CFX–TPP-2抑制MIAPaCa-2细胞生长的能力弱于NX–TPP和CFX–TPP-1（Figure 3A）。时间过程研究表明，使用台盼蓝染料排斥试验评估，细胞死亡在NX-TPP处理24–48小时后开始并 thereafter增加（Figure 3B）。TPP单独仅轻微抑制HT-29和MIAPaCa-2细胞生长（Figure 3C）。因此，与抗菌作用相反，TPP与NA和CFX共轭显著增强了对癌细胞系的生长抑制活性。NX–TPP和CFX–TPP-1处理的细胞显示出类似于坏死性细胞死亡的特征形态，如细胞膜气球样变和破裂（Figure S4A,B）。为了更详细地研究细胞死亡模式，我们检查了泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK（一种凋亡抑制剂）、受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）抑制剂necrostatin-1（一种坏死性凋亡抑制剂）和脂质过氧化抑制剂ferrostain-1（一种铁死亡抑制剂）对NX–TPP处理的HT-29和MIAPaCa-2细胞死亡的影响。结果显示，necrostatin-1轻微但显著改善了NX–TPP诱导的MIAPaCa-2和HT-29细胞死亡（Figure S5A）。免疫印迹分析显示，RIPK1和RIPK3的磷酸化（参与坏死性凋亡的关键信号分子）在NX-TPP处理的HT-29细胞中轻微升高（Figure S5B）。出乎意料的是，MLKL（RIPK3的底物和坏死性凋亡的执行者）的磷酸化降低，表明通过RIPK1/RIPK3/MLKL通路的坏死性凋亡未被诱导。相反，在NX-TPP处理的MIAPaCa-2细胞中未检测到RIPK1磷酸化和RIPK3表达，并且MLKL磷酸化降低（Figure S5B）。在NX-TPP处理的MIAPaCa-2细胞中观察到少量 cleaved poly(ADP-ribose)polymerase 1 (PARP1) (cPARP1)（DNA损伤、凋亡和坏死的标志物）。然而，在两种细胞系中均未检测到cleaved caspase-3 (CC3)（凋亡的标志）。在两种NX-TPP处理的细胞系中几乎未观察到谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)（铁死亡标志物）的降解（Figure S5B）。基于这些发现，我们得出结论，NX-TPP主要在MIAPaCa-2和HT-29细胞中诱导坏死。正如在其他细胞类型中报道的那样，necrostatin-1可能靶向参与坏死诱导的替代关键因子。

我们检查了其他癌细胞系对NX–TPP和CFX–TPP-1的敏感性，并观察到细胞系（Ls174T、KP4、MDA-MB-231、MDA-MB-468、HeLa和A549）在NX–TPP处理后存活率下降，并具有相似的形态变化，而SW480和PANC-1细胞相对耐药（Figures S4C和S6）。NX–TPP在抑制敏感细胞系存活方面比CFX–TPP-1略有效。SW480和PANC-1细胞对CFX–TPP-1耐药（Figure S6）。作为耐药机制之一，我们比较了HT-29和SW480细胞以及MIAPaCa-2和PANC-1细胞对NX–TPP和CFX–TPP-1的摄取。NX–TPP和CFX–TPP-1在HT-29和MIAPaCa-2细胞中的积累均高于SW480和PANC-1细胞（Figure S7A）。由于（氟）喹诺酮被多药耐药输出蛋白（MRP1、MRP2、MDR1和BCRP）和有机离子转运蛋白（OAT1和OCT1）输出和输入，我们测量了它们在细胞系中的mRNA表达水平，并观察到耐药SW480和PANC-1细胞中分别有高MDR1和MRP1表达。MRP2和BCRP表达水平与细胞对MitoQNs的敏感性无关（Figure S7B）。在SW480和PANC-1细胞中分别在蛋白质水平证实了MDR1和MRP1的高表达（Figure S7C）。MDR1抑制剂tariquidar和MRP1抑制剂II reversan分别使SW480和PANC-1细胞对NX–TPP敏感（Figure S7D），证实了MDR1或MRP1参与MitoQN耐药。

接下来，我们探讨了NX–TPP和化疗药物对HT-29细胞存活的联合效应。为此，我们在存在或不存在50 μM NX–TPP的情况下，用亚最佳浓度的5-氟尿嘧啶（5-FU）、SN-38、紫杉醇（PTX）和顺铂（CDDP）处理细胞72小时。联合治疗似乎比单一治疗更能增强细胞毒性（Figure S8）。

3.5 MitoQN Localization in Mitochondria

我们使用MIAPaCa-2细胞检查了NX–TPP和CFX–TPP-1在线粒体中的定位，因为它们不像HT-29细胞那样形成岛状（Figure S4A）；因此，它们的线粒体比HT-29细胞更容易区分（Figure S9）。MIAPaCa-2细胞与化合物孵育24小时，然后用MitoTracker Red染色。固定后，对细胞进行TPP免疫染色。使用ImageJ软件在共聚焦图像上定量MitoTracker Red (MitoT-Red)⁺区域和TPP⁺区域，并计算TPP⁺/MitoT-Red⁺的百分比作为线粒体定位的指标。结果显示，NX–TPP在线粒体中的定位远多于CFX–TPP-1（Figure 4）。

3.6 Effects of NX–TPP on Mitochondrial Homeostasis

考虑到其抗菌和抑制癌细胞系生长的活性，我们专注于NX–TPP并详细研究了其对线粒体稳态的影响。我们观察到NX–TPP在处理3小时后增加了线粒体活性氧（mtROS）生成（Figure 5A）。由于增强的mtROS生成触发线粒体自噬，导致通过自噬选择性去除线粒体，我们评估了NX–TPP处理的MIAPaCa-2细胞中的线粒体自噬。结果显示，NX–TPP在处理3小时内刺激了线粒体自噬（Figure 5B）。使用细胞外通量分析仪进行的细胞有丝分裂应激测试显示，在NX–TPP处理后约3小时，HT-29细胞的基础呼吸、最大呼吸和ATP生产耦合呼吸速率降低，尽管此时仍不显著（Figure S10A）。延长处理24小时进一步将线粒体呼吸降低至未处理HT-29和MIAPaCa-2细胞的约30%和50%（Figure 6A, Figure S10B）。NX–TPP而非NA显著降低了HT-29和MIAPaCa-2细胞中的mtDNA拷贝数（Figure 6B）。NX–TPP的减少是时间依赖性的（Figure S11A），并且在MitoQNs中最为显著（Figure S11B）。

3.7 Effect of the NX-TPP on Non-Cancerous Cells

我们检查了NX-TPP对非癌细胞的影响，包括HDFs、HUVECs和HEK293细胞。HEK293细胞不是经典的癌细胞系，但在某些条件下可表现出致瘤性。这些细胞对NX-TPP表现出强耐药性，即使在测试的最高浓度下也未观察到细胞死亡（Figure S12A,B）。与HT-29和MIAPaCa-2细胞相比，NX-TPP对HDFs、HUVECs和HEK293细胞中mtDNA拷贝数的影响要小得多，处理72小时后（Figure S12C）。机制上，这些非癌细胞的NX-TPP摄取低于MIAPaCa-2细胞（Figure S13A）。HDFs和HUVECs均表达MRP1蛋白，仅具有最低水平的MDR1，而HEK293细胞表达MDR1和MRP1蛋白（Figure S13B）。与NX-TPP联合，reversan对HDFs和HUVECs的存活影响最小，而tariquidar和reversan均显著降低了HEK293细胞的存活（Figure S13C,D）。

3.8 Effect of NX–TPP on Tumor Growth and Toxicity in HT-29 and MIAPaCa-2 Xenograft Mouse Models

我们在HT-29肿瘤的异种移植小鼠模型中测试了NX–TPP的抗癌活性。小鼠皮下注射HT-29，当肿瘤体积达到约100 mm³后，每隔一天腹腔注射单独载体作为对照或100 mg/kg NX–TPP（n=7只小鼠/组）。我们观察到，与对照组小鼠相比，NX–TPP处理的小鼠肿瘤生长显著延迟（Figure 7A）。在整个实验过程中未观察到体重减轻（Figure 7B）。为了检查NX–TPP的终点组织分布，对肿瘤和器官组织切片进行了TPP免疫组织化学染色。结果显示肿瘤中染色强烈（Figure 7C）和肝脏中染色强烈（Figure S14A）。肺和肾脏染色较弱，而脾脏未染色。在肝脏中，肝细胞和Kupffer细胞为TPP⁺，Kupffer细胞染色强烈。在肾脏中，肾小管上皮为TPP⁺，而肾小球细胞几乎为TPP^?。正常器官组织的HE染色显示无炎症或组织损伤迹象（Figure S14B）。与对照组小鼠相比，NX–TPP处理的小鼠肿瘤组织中Ki-67⁺细胞数量显著减少（Figure 7D），而CD31⁺区域几乎相等（Figure S14C）。类似地，NX–TPP给药抑制了MIAPaCa-2肿瘤的生长并减少了Ki-67⁺细胞的数量，且未引起体重减轻或生化血液指标的显著异常（Figure S15）。这些数据表明NX–TPP抑制肿瘤生长且在小鼠中耐受性良好。

4 Discussion

几种抗菌药物通过靶向线粒体在临床前癌症模型中显示出抗癌作用；然而，它们的线粒体积累仍然有限。这在喹诺酮中观察到；因此，需要高浓度来抑制癌细胞增殖。在这项研究中，我们基于TPP与喹诺酮共轭可能增加其在线粒体中的积累从而增强其抗癌作用的假设，合成了三种MitoQNs：NX–TPP、CFX–TPP-1和CFX–TPP-2。在评估它们的抗癌作用之前，我们检查了它们的抗菌活性，并观察到MitoQNs与亲本喹诺酮相比显著降低了对大肠杆菌DNA旋转酶和生长的抑制活性。由于TPP与C3-羧酸和C7-哌嗪基团的共轭都降低了抗菌活性，这可能不是由于共轭位点的差异。推测喹诺酮-TPP共轭物增加的亲脂性可能是导致减少的原因，因为TPP是亲脂性部分，并且喹诺酮化合物中增加的亲脂性通常会降低抗菌活性。如上所述，细菌抗生素耐药性可能导致严重的临床问题；因此，MitoQNs降低的抗菌活性可能减少选择压力从而降低耐药性风险，因此有利于最小化喹诺酮耐药风险。然而，MitoQNs是否确实减少了耐药菌的出现应予以研究。

我们观察到NX–TPP、CFX–TPP-1和CFX–TPP-2在相当低的浓度下可比地抑制癌细胞存活，远低于NA和CFX。这些MitoQNs表现出 comparable efficacy的原因，尽管在DNA旋转酶活性抑制方面存在显著差异，仍不清楚。细胞膜通透性、外排、线粒体摄取和/或对线粒体II型拓扑异构酶的亲和力的差异可能 involved。我们的数据表明，NX–TPP在线粒体中的积累优于CFX–TPP-1。然而，我们不能排除其他靶点可能 involved的可能性。

NX–TPP和CFX–TPP-1均在HT-29和MIAPaCa-2细胞中诱导细胞膜气球样变和破裂，表明MitoQNs诱导坏死样细胞死亡。坏死性凋亡标志物MLKL磷酸化的缺失、凋亡标志物caspase-3的 cleavage以及铁死亡标志物GPX4降解的缺失也支持了坏死性细胞死亡的发生。尽管导致细胞死亡的信号通路尚未完全阐明，我们的数据表明线粒体 dysfunction involved。NX–TPP早在3小时就诱导了mtROS生成和线粒体自噬。NX–TPP随后在处理约6小时后降低了耗氧率（OCR）水平。此外，NX–TPP在24小时及之后减少了mtDNA拷贝数，表明它通过抑制mtDNA维持机制抑制了mtDNA复制，最终导致mtDNA消除和严重的线粒体 dysfunction。这些变化在细胞死亡之前被观察到，细胞死亡在NX–TPP处理48小时后被检测到。

正如常规化疗药物常见的情况，几种细胞系对MitoQNs耐药。氟喹诺酮被ABC转运蛋白如MRP1、MRP2、MDR1和BCRP输出。此外，MDR1和BCRP限制TPP共轭化合物在脑中的摄取。我们的数据表明，NX–TPP和CFX–TPP-1在PANC-1和SW480细胞中的细胞内积累分别低于MIAPaCa-2和HT-29细胞。此外，SW480和PANC-1细胞中分别有高MDR1和MRP1表达，表明这些ABC转运蛋白在MitoQN耐药中发挥作用。实际上，tarquidar和reversan分别使SW480和PANC-1细胞对NX-TPP敏感。值得注意的是，非癌细胞，如HDFs和HUVECs，对NX-TPP耐药，表现出显著低于癌细胞系的NX-TPP摄取。尽管这些细胞表达MRP1，但reversan对其存活影响很小，表明在HDFs和HUVECs中存在赋予对NX-TPP耐药性的替代机制。然而，需要进一步研究来阐明这些潜在机制。

在我们之前的体内实验中，TPP共轭的吡咯-咪唑聚酰胺在腹腔注射后无需额外递送工具即可有效积累在皮下肿瘤内。类似地，NX–TPP在腹腔注射后成功递送至HT-29皮下肿瘤。肿瘤生长显著延迟，并且与对照组相比，NX–TPP处理的小鼠中Ki-67⁺细胞数量减少，表明体内HT-29和MIAPaCa-2细胞增殖受到抑制。NX–TPP处理通过CD31免疫染色评估对肿瘤血管生成几乎没有影响。在所用剂量下未观察到体重减轻、器官组织宏观损伤或生化血液测试的严重异常。在检查的器官中，NX–TPP积累在肝脏的肝细胞和Kupffer细胞以及肾脏的肾小管上皮中。这种分布可能反映了其肝脏代谢和尿液排泄。NX–TPP在肾小球细胞中的 minimal accumulation是令人鼓舞的，因为这些细胞的损伤通常是不可逆的。因此，总体而言，NX–TPP被小鼠良好耐受。尽管我们观察到轻微的肿瘤抑制效应，我们期望通过剂量和给药方法的优化进一步提高NX–TPP的疗效。NX–TPP与常规化疗药物的组合可能有助于这些改进。

总之，我们的研究表明MitoQNs降低了癌细胞系的存活，但对HDFs和HUVECs仅轻微影响。尽管某些癌细胞系耐药，这项研究突出了MitoQNs作为抗癌药物的潜力。积累的证据表明，靶向各种线粒体功能（包括代谢、电子传递、糖酵解、氧化还原平衡和凋亡信号通路）的药物可用于癌症治疗。其中之一是线粒体转录抑制剂，其在人类癌细胞异种移植中诱导强抗肿瘤作用，但在正常组织中不表现出毒性。最近的一份报告表明，类似于CFX–TPP-2的Mt–CFX在异种移植小鼠模型中减少乳腺癌症生长且无不良反应。由于许多喹诺酮衍生物已被开发，合成此类与线粒体靶向部分共轭的喹诺酮可能值得进一步研究。