提莫菲维小麦花药培养首次实现双单倍体再生：为小麦育种与有机农业开辟新途径

　　针对提莫菲维小麦（Triticum timopheevii）体外再生困难、缺乏双单倍体（DH）生产体系的问题，研究人员首次通过花药培养（AC）成功诱导胚胎发生和植株再生。优化后的NPB-99培养基效果最佳，每100个花药（100A）可产生约1株绿苗（GP），其中42%为自发双单倍体。该研究为利用其独特G基因组及抗逆性状改良普通小麦提供了关键技术突破。

　　

提莫菲维小麦（Triticum timopheevii）作为一种四倍体小麦物种（2n=4x=28，AAGG），因其独特的遗传特性、优异的抗逆性和巨大的育种潜力而备受关注。然而，由于体外再生能力差、白化苗（AP）发生率高，其在组织培养中的应用一直受限。特别是在双单倍体（DH）生产领域，此前尚未建立有效的 androgenesis（雄核发育）技术体系。这种技术瓶颈严重阻碍了该物种在杂交育种和遗传改良中的充分利用。正是在这样的背景下，研究人员以育种品系Georgya为材料，开展了提莫菲维小麦花药培养的首次系统性研究，旨在建立其DH植株再生 protocol，为后续育种应用提供基础。

本研究主要采用了以下关键技术方法：1） 使用Georgya育种系（来自EGI-SET种质库，编号20764）作为供体材料；2） 通过显微观察筛选晚期小孢子阶段的穗子，并进行两周4°C冷预处理；3） 比较三种液体诱导培养基（NPB-99、C17、190-2）的效果，并测试了组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin-A（TSA）的添加以及普通小麦 pistils（雌蕊） nurse culture（看护培养）的影响；4） 利用流式细胞术（flow cytometry）分析再生植株的 ploidy level（倍性水平）。

Effect of induction medium

实验比较了三种诱导培养基的效果。NPB-99培养基在胚胎状结构（ELS）形成、胚胎发育和绿苗（GP）再生方面均表现最佳，平均每100个花药（100A）可产生约21个ELS和1株GP。C17培养基虽产生的胚胎数量较少（约7个/100A），但胚胎形态发育良好。190-2培养基效果最差，GP再生率仅0.3/100A。结果表明，NPB-99是提莫菲维小麦花药培养的最适诱导培养基。

Effect of TSA supplementation

在NPB-99培养基中添加0.01μM TSA并未显著提高androgenic response。虽然ELS数量略有增加，但胚胎成熟和GP再生均未得到改善，表明白化苗比例仍高达72%-78%。持续暴露于TSA可能对胚胎后期发育产生抑制作用，暗示未来研究需优化TSA的处理时机和浓度。

Effect of nurse culture

使用普通小麦雌蕊进行看护培养是诱导androgenesis的关键。未条件化培养基无法产生胚胎，而使用纵向切半的雌蕊进行培养基条件化可使ELS产量提高近30%（29 ELS/100A vs. 19 ELS/100A），表明雌蕊释放的 nurse factors（看护因子）对提莫菲维小麦小孢子胚胎发生具有显著促进作用。

Albinism frequencies

白化苗现象极为严重，在不同培养基中AP比例高达75%-96%。这种高白化率可能与提莫菲维小麦特有的AAGG基因组（特别是G基因组）的互作有关，与其他不含G基因组的小麦物种相比，其更易产生叶绿体发育缺陷。

Spontaneous diploidization

流式细胞术分析显示，在所有再生绿苗中，42%为自发双单倍体（DH），49%为单倍体（H），另9%为六倍体（推测基因组为AAAGGG）。单倍体植株表现为不育、矮小、分蘖增多等典型特征，而六倍体植株虽生长旺盛但亦不育。自发加倍率较低表明，未来需结合人工加倍（如抗有丝分裂剂处理）以提高可育DH植株的生产效率。

Future prospects

本研究初步建立了提莫菲维小麦花药培养体系，但效率仍较低（约1 GP/100A）。后续需进一步优化培养条件（如TSA处理时序、看护培养方式），并扩大基因型测试范围。初步杂交实验表明，androgenic response存在基因型依赖性，提示遗传改良亦是提高效率的重要方向。

本研究首次在提莫菲维小麦中实现了花药培养诱导的双单倍体植株再生，突破了该物种在DH育种中的技术瓶颈。尽管当前效率较低且面临白化苗率高、自发加倍率不足等问题，但所建立的NPB-99培养基体系、雌蕊看护培养技术以及倍性鉴定方法为后续研究奠定了坚实基础。该成果对挖掘提莫菲维小麦的优异基因资源（如抗病性、抗逆性、细胞质雄性不育系统CMS）以及推动其在普通小麦改良和有机农业中的应用具有重要意义。未来通过持续优化培养策略和解析G基因组的再生障碍机制，有望充分发挥该物种在可持续农业中的潜力。