基于线性聚甘油的脂质：作为PEG替代物的下一代脂质纳米颗粒用于先进药物递送系统

　　本文综述了线性聚甘油（lPG）作为聚乙二醇（PEG）的潜在替代物在脂质纳米颗粒（LNP）中的应用。研究通过合成不同极性和链长的lPG衍生物两亲物，系统评估了其制备的mRNA-LNP系统的粒径、稳定性、封装效率、抗PEG抗体结合活性、细胞毒性及转染效率。结果表明，lPG功能化的LNP能有效规避抗PEG抗体识别，同时保持与PEG-LNP相当的mRNA递送效率和细胞转染能力，为克服PEG免疫原性难题提供了新策略。

　　

ABSTRACT

聚乙烯醇（PEG）被广泛应用于各类治疗性制剂中以提供“隐形”效应，然而患者体内抗PEG抗体发生率的上升可能导致免疫副作用及血液清除加速，从而降低PEG基递送载体的效率。脂质纳米颗粒（LNPs）作为含PEG的载体之一，可有效递送核酸；其在COVID-19大流行期间开发的mRNA疫苗中已展现出未来治疗多种疾病的巨大潜力。因此，本研究旨在利用线性聚甘油（lPG）作为替代性隐形聚合物，以规避抗PEG抗体，同时实现mRNA递送。研究表明，lPG功能化的LNP与IgG抗PEG抗体的结合可忽略不计，并能成功将eGFP mRNA递送至HepG2细胞，其转染效率与PEG化LNP相当。

1 Introduction

PEG长期以来因其改善药物代谢动力学和生物相容性的能力而成为药物递送领域的重要材料。PEG化脂质在近期冠状病毒大流行中对mRNA疫苗的开发起到关键作用，这是治疗多种疾病的一种有前景的治疗策略。PEG化脂质是脂质纳米颗粒（LNPs）的关键组分，用于封装和递送mRNA疫苗，如辉瑞- BioNTech和Moderna的COVID-19疫苗。这些LNP保护脆弱的mRNA分子，增强其稳定性，并促进递送至靶细胞，最终产生靶蛋白以对抗目标疾病。商业LNP制剂通常包含四种不同脂质：可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和稳定脂质（通常为PEG基），以提供胶体稳定性和隐形效果。然而，尽管PEG脂质在mRNA疫苗中起到关键作用，其仍存在若干缺点，包括免疫原性、潜在毒性或不可生物降解性等担忧。更令人担忧的是，近几十年来抗PEG抗体浓度的急剧增加与过敏反应、过敏性休克相关，并可能因对PEG的预存免疫力而降低疫苗效率。这些抗PEG抗体可能对聚合物主链具有更高亲和力，或靶向常用于治疗制剂的mPEG的甲氧基端基。此外，Lee等人2024年最近发现，附着于LNP的PEG比游离PEG alone诱导更强的IgM抗PEG抗体反应。应对这些挑战对于优化疫苗安全性、有效性及可及性至关重要，以建立针对多种疾病的mRNA疗法。

近年来，越来越多的研究致力于探索高级药物递送系统（包括LNP）中的PEG替代物。这些替代物涵盖聚肌氨酸（pSar）、聚（2-恶唑啉）（pOx）和线性聚甘油（lPG）。作为甘油的结构衍生物，lPG是一种生物相容性高且可功能化的聚合物，因此成为本研究的焦点。与PEG类似，lPG是一种亲水聚合物，由多个通过醚键连接的甘油单元组成。其独特结构相较于PEG具有若干优势，包括增强的稳定性、降低的免疫原性和改善的可生物降解性。此外，其特定性能——如尺寸、分子量和表面功能——可被定制，使其高度适用于各种药物递送应用。此类聚合物因能够封装广泛治疗剂（包括小分子、肽、蛋白质和核酸）而受到显著关注，实现向靶组织递送并提高效率、减少副作用。我们的研究专注于建立lPG作为LNP中PEG的替代物用于封装mRNA的制剂，重点研究不同lPG链长和甲氧基功能化的lPG。这些结构相似的聚合物提供了关于亲水和两亲聚合物如何影响LNP内脂质结构的见解。

商业mRNA-LNP制剂的一个主要成分是DMG-PEG2000（如Moderna的SpikeVax中所用），其在给药时提供隐形效果并限制免疫原性。这些聚合物脂质包含一个mPEG链（平均分子量2000 g mol^?1），具有末端甲氧基，并通过醚键与二肉豆蔻酰甘油共价连接。虽然有效，但所得mPEG脂质易被抗PEG抗体检测和结合，可能导致对PEG敏感患者的抗原反应。这些抗体日益普遍及其影响促使我们研究lPG衍生物作为mRNA负载LNP疫苗的PEG替代物。为此，我们将不同lPG结构通过醚键接枝到肉豆蔻酰甘油上，以便在并入LNP时与DMG-PEG2000进行直接比较。

lPG变体被设计为复制PEG2000的分子量或链长，且所有变体均具有至少一个末端甲氧基。所得具有可比链长且无额外甲氧基的lPG可能在结构上与PEG最为相似。此外，MeOlPG、lPG-嵌段-MeOlPG和MeOlPG-嵌段-lPG被修饰以在聚合物主链上包含甲氧基。MeOlPG用于评估采用更简单聚合物合成的LNP。通过改变lPG-嵌段-MeOlPG和MeOlPG-嵌段-lPG中功能基团的顺序，我们希望更好地了解聚合物主链上的额外极性和潜在空间位阻。每种lPG变体均与两个C-14烷基链共价连接，镜像DMG的脂质尾部并提供两亲特性。所得两亲聚合物随后被纳入mRNA-LNP制剂中，以评估聚合物特性（如极性和链长）对LNP结构的影响。最后，通过封装eGFP mRNA来量化这些含lPG的LNP的递送效率，以在细胞内释放和mRNA翻译后产生eGFP。

2 Results and Discussion

本研究旨在研究lPG作为mRNA LNP系统中PEG的替代物，以限制抗PEG抗体的结合，同时保持隐形效果和转染效率。为此，我们合成了具有不同极性和链长的lPG衍生物两亲物。这些两亲物随后被制成mRNA LNP系统，并分析其mRNA递送和细胞内转染情况。

2.1 Synthesis of Polyglycerol Lipids

本研究的聚合物主链（lPG和MeOlPG）通过活性阴离子聚合制备，以2,3-双（苄氧基）丙烷-1-醇作为引发剂，与相应的环氧单体反应，随后在甲苯中于干燥条件下通过氢化进行脱苄基化。在功能化双酯部分之前，使用凝胶渗透色谱（GPC）测定每种聚合物的分子量和相应重复单元数。PEEGE显示出较低的洗脱体积，与其较高的分子量（3676 Da）一致。尽管PEEGE在后续合成中的去保护会降低分子量，但重复单元数保持不变，并可从该数据推断。嵌段共聚物的成功形成通过其洗脱峰出现在均聚物之间及其分子量分布跨越两种均聚物来确认。

分子量测定后，将二醇功能化的lPG与肉豆蔻酰氯偶联以获得双酯部分。对于含EEGE的聚合物，通过去保护缩醛保护的侧链获得羟基侧链。共聚物通过类似路线制备，仅涉及在开环聚合步骤中逐步添加不同的环氧单体。所有合成的聚合物均通过光谱技术进行表征。

2.2 Biophysical Characterization of LNPs

2.2.1 Size and Stability of LNPs

通过微流控混合水相和有机相制备LNP。水相中带负电的mRNA与有机相中的可电离阳离子脂质形成稳定复合物。有机相中剩余的脂质围绕这些复合物自组装形成mRNA-LNP系统。最后，使用超滤离心进行缓冲液更换至储存缓冲液，然后使用DLS测量所得LNP系统的尺寸和PDI。理想的纳米颗粒直径在60-150 nm范围内，以促进细胞摄取并产生稳健的免疫反应。此外，低PDI是表征具有窄尺寸分布的均质群体的指标。纳米颗粒的尺寸可能因隐形脂质的存在而减小，这是由于自组装过程中的空间位阻减少了颗粒团聚。

在本研究中，微流控工艺流条件经过优化，使PEG-LNP的平均颗粒尺寸为110.0 nm（PDI 0.045）。具有与PEG2000相似链长（分别为42 vs. 44个重复单元）的lPG产生了所有测试lPG变体中最小的LNP，其次是MeOlPG-嵌段-lPG。相比之下，MeOlPG和lPG-嵌段-MeOlPG的较短链长提供的隐形效果有限，形成了显著更大的颗粒。不同的链长限制了对两种嵌段共聚物进行比较所能得出的结论，但可能表明LNP尺寸与沿lPG主链的额外功能基团无关。

与其他PEG替代物（如pSar-LNP系统）先前观察到的情况一致，lPG-与PEG-LNP系统相对较大的尺寸并非我们制剂特有的限制。尽管如此，调整生产参数可能有助于减小lPG-LNP直径。通过改变微流控设置（例如，微流控芯片构型、流速/比例）或水相缓冲液类型，先前的工作表明减小纳米颗粒尺寸是可能的。增加隐形脂质的摩尔量可以减小LNP尺寸，但会以降低生物利用度、细胞摄取和更高的抗PEG抗体激活为代价。

Zeta电位可为LNP制剂提供额外见解，因为强电化学电荷（～ ±30 mV）可提高颗粒排斥以改善胶体稳定性，但也会导致循环半衰期缩短和细胞毒性增加。测试的lPG-LNP的Zeta电位在-4.10（MeOlPG-嵌段-lPG）和-6.78 mV（MeOlPG）之间，而PEG化LNP的Zeta电位为-3.30 mV。由于所有制剂均显示近乎中性的Zeta电位，因此不太可能因过量电荷导致细胞毒性。

通过DLS测量mRNA-LNP在4°C下的胶体储存稳定性，证明颗粒直径在3周内变化可忽略不计。lPG功能化能够提供与PEG化相当的聚合物隐形效果。唯一例外是MeOlPG-LNP，其在测量期间直径和PDI增长，这可能归因于MeOlPG相对较短的链长提供的隐形效果较少，导致在4°C储存时颗粒团聚。

通过比较未封装（游离）mRNA与 TritonX-100 裂解脂质膜后释放的封装mRNA来评估mRNA的封装效率。lPG-LNP具有最高的封装效率（93.4%），其次是lPG-嵌段-MeOlPG（79.4%）、MeOlPG-嵌段-lPG（78.1%），最后是MeOlPG-LNP（61.9%）。因此，lPG可能形成紧凑（尽管稍大）的LNP，其封装效率与PEG-LNP相当。虽然在研究的嵌段共聚物中添加一些甲氧基略微降低了mRNA封装，但MeOlPG具有完全甲氧基化的聚合物主链。这一特性可能导致团聚并形成大的、松散堆积的MeOlPG-LNP，且mRNA突破颗粒表面从而降低封装效率。

2.2.2 Cryo-TEM Measurements to Assess LNP Morphology

在微流控生产后立即（第0天）和在PBS中4°C储存4周后对eGFP mRNA LNP系统进行Cryo-TEM成像。在第0天，LNP表现为纳米范围内的单层囊泡，与先前的DLS测量一致。正如预期，由于相对较高的N/P比为6，明确的层状结构存在有限。值得注意的是，当用lPG变体替代PEG时，LNP形态呈现出可见的脂质双层壳而非单层，包围着无定形的电子致密核心。这种“固体核心”形态可能由内部油相组成，其中包含去质子化的可电离脂质和mRNA。尽管PEG-和lPG-LNP之间存在这些形态差异，但基于先前描述的结果，mRNA封装能力可能得以保持。

储存4周后，所有LNP制剂均观察到轻微的结构变化，包括脂质单层增厚和mRNA排出。然而，制备数周后主要完整的lPG-LNP系统的存在支持了先前的稳定性数据，并可能表明其对未来治疗应用具有足够的稳定性。

2.2.3 Anti-PEG Antibody Activation

PEG化治疗剂的一个主要担忧是给药后抗PEG抗体的激活，导致加速血液清除（ABC）和超敏反应。为了观察潜在的抗原性和交叉反应性，我们评估了lPG-LNP与抗PEG抗体的抗炎活性。先前研究发现，使用人血清抗PEG IgG与市售动物抗PEG IgG的ELISA结果具有良好一致性。在本测定中，我们使用兔单克隆IgG抗PEG抗体，其通过范德华力和氢键相互作用选择性结合mPEG的末端甲氧基。尽管所有lPG变体均包含末端甲氧基，但它们与抗PEG抗体的结合亲和力可忽略不计。ELISA测量显示结合浓度分别为0.83（lPG）、0.50（MeOlPG）、0.68（lPG-嵌段-MeOlPG）和0.66 ng mL^?1（MeOlPG-嵌段-lPG）。相比之下，2 mol%和0.2 mol%的PEG-LNP显示出显著升高的结合活性（分别为1310.55和816.81 ng mL^?1）。需要将PEG-LNP稀释100倍才能将其抗PEG抗体结合降低至与lPG-LNP相当的水平（0.58 ng mL^?1，p < 0.05）。

这是一个有希望的结果，因为mPEG先前已与其他PEG衍生物相比与高抗PEG抗体滴度相关。此外，已知PEG主链中的C─C─O motif通过疏水相互作用促进抗体识别，每个单体有3-7个抗体结合位点。用lPG替代PEG时C─C─O单元亲水性的增加可能破坏此类相互作用，并且对于未来评估lPG-LNP的抗原性仍然值得关注。

此外，其他PEG替代物如pOx和pSar已被证明可逃避抗PEG抗体的识别。与这些发现一致，我们的观察表明lPG功能化的LNP也可能逃避抗体识别，表明重复给药时ABC效应的可能性降低。总之，这些发现进一步支持lPG作为mRNA递送的有前景的PEG替代物。

2.2.4 Cell Viability of HepG2 Cells

为了评估lPG-LNP用于基因递送应用，使用CCK8测定法在体外评估了与mRNA lPG-LNP系统共孵育的HepG2细胞的细胞活力。由于脂质浓度可能因制剂而异，使用每个样品的mRNA浓度评估细胞活力。这种方法也便于与后续转染实验保持一致，这些实验使用等效的mRNA剂量进行。鉴于每种LNP制剂的近中性Zeta电位以及lPG已知的生物相容性，预期细胞毒性最小。当与高达1 μg mL^?1的mRNA浓度共孵育时，细胞活力超过80%，表明在适当剂量下无细胞毒性行为。具体而言，在1 μg mL^?1 mRNA时，最高的细胞活力见于lPG-嵌段-MeOlPG LNP（95.4%），与PEG-LNP（95.6%）相当。在1 μg mL^?1 mRNA时，最低的细胞活力与lPG-LNP（90.4%）相关，总体而言与MeOlPG-LNP相关（在0.5 μg mL^?1时为83.4%）。然而，所有观察到的跨制剂和浓度的差异在统计上均不显著。这些结果表明，对lPG主链的修饰，如增加极性或改变分子量，似乎对细胞活力的影响可忽略不计。

2.2.5 Transfection of eGFP mRNA Delivered to HepG2 Cells

由于细胞摄取和转染效率先前已被描述为依赖于PEG链长或PEG化程度，我们试图研究lPG-LNP中的类似因素是否影响递送和细胞内mRNA释放。为了模拟mRNA递送，用封装eGFP编码mRNA的lPG-LNP转染HepG2细胞。随后的荧光显微镜显示成功的细胞摄取和mRNA翻译以在整个细胞中表达eGFP。这些结果表明，当在LNP制剂中用lPG变体替代PEG时，转染能力得以保持。

由于HepG2细胞倾向于聚集并形成簇，通过流式细胞术进行更详细的分析以量化单个细胞的荧光以及表达eGFP的细胞比例。每个细胞的 median 荧光强度在所有lPG-和PEG-LNP中范围从3068.0到3890.0，与聚合物长度、功能化和mRNA剂量无关。结果表明所有测试的lPG变体均能实现有效的细胞内递送和mRNA释放，即使在低至0.05 μg mL^?1的浓度下（对应于每孔接种密度为10 000个细胞时每个细胞约0.05 pg mRNA）。先前研究表明，仲胺端基（如pSar功能化LNP中所见）可提供轻微正电荷以与带负电的细胞膜相互作用并增强mRNA递送。鉴于lPG高度可功能化的主链，引入类似带电部分可能提供改善细胞摄取的有前景策略。

虽然所有LNP系统均成功递送mRNA，但递送效率因制剂而异。约43%的用lPG-或MeOlPG-LNP处理的细胞表现出eGFP荧光。观察到剂量依赖性反应，在较低mRNA浓度下eGFP表达下降至约30%。甲基化和侧基极性的差异似乎影响可忽略不计，如这些制剂之间不显著的差异所示。值得注意的是，转染效率不受MeOlPG-LNP较低的初始封装效率和增加的颗粒直径的影响。

有趣的是，向LNP添加嵌段共聚物略微降低了转染效率，在较高mRNA浓度下降至约40%，在较低浓度下降至约25%。超过24小时的转染效率降低可能是由于在LNP制剂中使用嵌段共聚物而非均聚物时转染速率较慢。尽管先前研究表明转染效率依赖于聚合物链长，但未观察到这种效应——可能是由于测试聚合物重复单元数差异不大（lPG为42 vs. MeOlPG为27），这可能不足以显著影响细胞摄取。

3 Conclusion

我们的研究成功建立了不同的线性聚甘油（lPG）作为生物相容性、亲水聚合物，当与烷基链共价连接时可以成功形成两亲结构。这些lPG两亲物可用作mRNA递送LNP制剂中商业标准PEG的适当替代物，具有相当的转染效率。作为LNP制剂中PEG替代物的最有希望的候选者是线性聚甘油（lPG），其具有与PEG2000相似的链长。虽然能够提供具有相似尺寸、稳定性和转染效率的LNP，但lPG与抗PEG抗体的结合可忽略不计。相比之下，具有显著较短链长和甲氧基化聚合物主链的MeOlPG导致相似的抗体结合，但由于mRNA负载低，需要更大体积才能实现相似的转染效率。总体而言，新型PG基脂质显示出细胞与mRNA的稳定转染以及与抗PEG抗体的低交叉反应性。

4 Experimental Section

4.1 Materials and Analytical Methods

聚合物合成所需的所有市售化合物购自Sigma–Aldrich或TCI。为监测反应进程，使用预涂层薄层色谱（TLC）板（Merck silica gel 60F254），使用高锰酸钾溶液可视化TLC板上的斑点。使用JEOL的ECP500（500 MHz）和Bruker的Avance 500（500 MHz）测量NMR谱。在四氢呋喃中使用Agilent的SECcurity 1200进行凝胶渗透色谱（GPC）。

对于LNP制剂，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC, CAS: 816-94-4）和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2000, CAS: 160743-62-4）购自Avanti Polar Lipids。LP-01 (CAS: 1799316-64-5) 购自WuXi Biologics（无锡市，中国）。Poly(A) mRNA购自Roche，而Reporter eGFP mRNA购自TriLink Biotechnologies (L-7601)。使用Quant-iT Ribogreen RNA Assay (ThermoFisher) 量化RNA浓度。竞争性酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自Abcam (ab215546)。对于细胞工作，购买高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM） with GlutaMAX supplement，以及Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Gibco, ThermoFisher）。Cell counting kit-8 (CCK-8) 购自Sigma–Aldrich (#96992, Merck)。

4.2 Synthesis

出于合成目的，我们遵循阴离子开环聚合，使用rac-2,3-双（苄氧基）丙烷-1-醇作为引发剂，与相应的环氧单体反应。然后将四种合成的聚合物脂质使用微流控技术制成LNP。

4.2.1 General Procedure for Anionic Ring-Opening Polymerization for Homopolymer Synthesis

线性聚甘油衍生物（作为lPG和MeOlPG前体的聚（乙氧基乙基 glycidyl ether）s (PEEGE)）通过活性阴离子聚合制备，使用rac-2,3-双（苄氧基）丙烷-1-醇 1 作为引发剂，与相应的环氧单体反应。引发剂 1 (0.25 g, 0.92 mmol) 溶解在KOtBu的THF溶液中（0.20 g, 1.8 mmol 在 5 mL THF中），在氩气气氛下加热至50°C 2小时以去质子化醇基团。生成的t-BuOH和溶剂在高真空下除去。剩余的醇盐引发剂完全干燥，重新溶解在干燥甲苯中，并在氩气气氛下加热至80°C。然后，将 freshly distilled monomer（ either rac-ethoxyethyl glycidyl ether (EEGE, 2, 3.0 mL, 21 mmol) for PEEGE, or rac-glycidyl methyl ether (3, 1.6 mL, 18 mmol) for MeOlPG）添加到醇盐甲苯溶液中，并在80°C氩气气氛下聚合24小时。反应通过首先冷却至室温，然后加入甲基碘（1 mL）并在室温下进一步搅拌2小时来淬灭。此后，混合物在减压下浓缩，随后在真空下干燥。为纯化，将获得的油溶解在Et₂O中并离心以分离不溶性盐。聚合物的进一步纯化通过快速色谱 followed by dialysis in acetone (1 kDa MWCO, RC tubing) for 3 days完成。双苄基功能化的PEEGE 2a 和 MeOlPG 3a 作为微黄色油获得，产率80%。

4.2.2 General Procedure of Anionic Ring-Opening Polymerization for Copolymer Synthesis

共聚化聚甘油（由lPG和MeOlPG组成）通过活性阴离子聚合制备，使用rac-2,3-双（苄氧基）丙烷-1-醇 1 作为引发剂，与相应的环氧单体反应。引发剂 1 (0.25 g, 0.92 mmol) 溶解在1 M KOtBu的THF溶液中（8.2 mL, 8.2 mmol），在氩气气氛下加热至50°C 2小时。生成的t-BuOH和溶剂在真空下除去。剩余的醇盐引发剂完全干燥，重新溶解在干燥甲苯中，并在氩气气氛下加热至80°C。对于共聚物 4a [Bn₂O-PEEGE-b-MeOlPG-OCH₃]，将 freshly distilled monomer ethoxyethyl glycidyl ether (2.0 mL, 14 mmol) 添加到混合物中并搅拌12小时，随后加入 glycidyl methyl ether (1.0 mL, 12 mmol) 作为MeOlPG的第二聚合物单元，并在80°C氩气气氛下进一步搅拌24小时。类似地，对于嵌段共聚物 5a [Bn₂O-MeOlPG-b-PEEGE-OCH₃]，将 glycidyl methyl ether (1.0 mL, 12 mmol) 添加到引发剂醇盐中并搅拌12小时，随后加入 ethoxyethyl glycidyl ether (2.0 mL, 14 mmol) 作为PEEGE的第二聚合物单元，在80°C氩气气氛下进一步聚合24小时。

反应通过加入甲基碘（1 mL）淬灭，类似于均聚物的合成。将混合物在室温下搅拌1-2小时，然后在减压下浓缩，随后在真空下干燥。为纯化，将获得的油溶解在Et₂O中并离心以分离不溶性盐。聚合物的进一步纯化通过快速色谱和丙酮透析（1 kDa MWCO, RC tubing）3天完成。双苄基功能化的嵌段共聚物 4a 和 5a 作为微黄色油获得。

4.2.3 General Procedure of Hydrogenative Debenzylation

lPG二苄基醚通过氢化在甲苯中用Pd/C（10% w/w）作为催化剂进行去保护。化合物 2a, 3a, 4a, 和 5a 各自溶解在甲苯中，并用氩气冲洗三次。然后将氢气冲洗入溶液中，反应在氢气气氛下室温放置3-4天。混合物通过Celite过滤以去除催化剂，滤液在减压下浓缩。二醇功能化的（Polymer-OCH₂CH(OH)CH₂OH）在高效真空干燥后作为无色粘稠油定量获得。

4.2.4 Synthesis