揭秘PEG-脂质锚链长度对siRNA-LNP抑制骨髓源性巨噬细胞P2y2受体功效的影响及其在免疫治疗中的潜力

　　本研究针对巨噬细胞P2Y2受体在炎症、感染和癌症疾病中的关键作用，开发了基于不同PEG-脂质锚链（DMG-PEG/DPPE-PEG/DSPE-PEG）的siRNA-LNP系统。研究发现DMG-PEG（C14）锚链的LNP在M2型巨噬细胞中展现出最优的基因沉默效果（90% knockdown），通过增强细胞质递送效率突破传统PEG困境，为巨噬细胞重编程免疫治疗提供了精准设计策略。

　　

在免疫系统的精密调控网络中，巨噬细胞如同双面间谍，既能维持组织稳态，又能驱动疾病发展。其中P2Y2受体作为ATP敏感的嘌呤能受体，在炎症反应、感染过程和肿瘤微环境中扮演着关键角色。近年研究发现，抑制P2Y2信号通路可重塑巨噬细胞功能，将其从抗炎的M2表型转化为促炎的M1表型，这为治疗癌症、自身免疫病和感染性疾病提供了新思路。然而，如何精准调控巨噬细胞内的基因表达一直是重大挑战——游离siRNA易被降解、细胞摄取效率低，且传统递送系统难以克服生物屏障。

为了解决这一难题，来自法国巴黎萨克雷大学的研究团队在《International Journal of Pharmaceutics》上发表了一项突破性研究。他们巧妙设计了三种不同脂质锚链长度的PEG-脂质 conjugate（DMG-PEG C14、DPPE-PEG C16、DSPE-PEG C18），通过微流控混合技术制备了靶向P2y2基因的siRNA-LNP系统，并在骨髓源性巨噬细胞（BMDM）模型中系统评估了其递送效率和基因沉默功能。

研究采用微流控技术制备标准化LNP，动态光散射表征粒径分布（76-92 nm），QuantiFluor? RNA系统检测封装效率（>80%）；利用流式细胞术分析巨噬细胞对荧光标记LNP的摄取情况；通过RT-qPCR定量检测P2y2基因沉默效率；采用共聚焦显微镜观察siRNA细胞内分布轨迹；使用商业转染试剂Lipofectamine? RNAiMAX作为阳性对照。

3.1. Preparation and characterization of siRNA-loaded LNPs

研究人员成功制备了三种PEG-脂质锚链的LNP，所有制剂均呈现纳米级粒径（76-92 nm）、低多分散指数（PDI<0.2）和高包封率（>80%）。在pH 4条件下所有LNP均带正电（+14.4至+22.7 mV），有利于内体逃逸，其中DMG-PEG制剂在pH 7时呈现最弱的负电性（-4.9 mV），提示其可能具有更好的细胞相互作用能力。

3.2. Cellular uptake of siRNA-loaded LNPs in BMDMs

流式细胞术显示所有LNP在M2型BMDM中均实现高效摄取（近100%），但DMG-PEG制剂显示最高的平均荧光强度。共聚焦显微镜观察发现DSPE-PEG处理的细胞中Cy5.5信号更饱和，表明完整LNP在细胞内的积累，而DMG-PEG则呈现更分散的分布模式。

3.3. P2Y2 gene silencing in BMDMs

基因沉默实验揭示显著差异：DMG-PEG-LNP在M2 BMDM中实现90%的P2y2敲低，效果优于商业转染试剂；DPPE-PEG-LNP达到70%沉默效率；而DSPE-PEG-LNP几乎无效。值得注意的是，M2巨噬细胞的沉默效率显著高于M0巨噬细胞，表明极化状态影响基因沉默效果。

3.4. Intracellular fate of siRNA-loaded LNPs in M2 BMDMs

共聚焦显微镜时间序列分析显示，DPPE-PEG和DSPE-PEG制剂导致siRNA在细胞内形成浓缩斑点，表明区室化滞留；而DMG-PEG制剂呈现弥漫性分布，提示高效细胞质递送。DSPE-PEG处理的细胞在48小时仍保持最强Cy5.5信号，证实其缓慢的脂质交换动力学。

3.5. Kinetics of siRNA-mediated P2Y2 gene silencing in M2 BMDMs

动力学研究表明DMG-PEG-LNP在8小时内即达到80%沉默效率，24小时稳定在90%；DPPE-PEG-LNP呈现延迟但持续的效果，48小时达到85%；而DSPE-PEG-LNP即使到72小时仅实现40-45%沉默。这种动力学差异与显微镜观察到的细胞内分布模式高度一致。

该研究得出结论：PEG-脂质锚链的长度是决定siRNA-LNP基因沉默效率的关键因素，其中短链DMG-PEG（C14）凭借其快速解离特性和增强的细胞质递送能力，在巨噬细胞重编程中展现卓越性能。研究首次揭示不同极化状态巨噬细胞对LNP递送的反应差异，为免疫治疗提供了重要设计原则——针对M2型巨噬细胞的精准靶向需要优化PEG-脂质锚链结构。

这项研究的深远意义在于突破了传统"PEG困境"（即PEG化在延长循环时间与降低细胞摄取效率间的矛盾），通过理性设计PEG-脂质锚链，实现了对巨噬细胞基因表达的程序化调控。不仅为开发新型肿瘤免疫疗法、炎症性疾病治疗方案提供了技术平台，更深化了对纳米载体-生物界面相互作用的科学认知，标志着纳米医学向精准免疫工程迈进的重要一步。