重构顶复门寄生虫铁氧还蛋白-MEP通路于大肠杆菌：一种用于抑制剂和必需酶突变筛选的原位平台

　　本研究针对顶复门寄生虫特有的MEP通路及其铁氧还蛋白氧化还原系统，构建了一种基于大肠杆菌的筛选平台。研究人员通过基因工程手段，成功将疟原虫和弓形虫的IspH、Fd及FNR蛋白在大肠杆菌中功能性表达，并验证了其互补生长能力。该平台可用于筛选靶向MEP通路的抑制剂和关键功能突变，为抗寄生虫药物开发提供了高效、易操作的体外工具，显著降低了在寄生虫中进行复杂实验的成本和时间。

　　

顶复门寄生虫是一类具有重要医学和兽医学意义的单细胞真核生物，包括引起疟疾的疟原虫（Plasmodium spp.）和引起弓形虫病的刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）。这些寄生虫体内有一个特殊的细胞器——顶质体（apicoplast），这是一种类似质体的细胞器，源于二次内共生事件。顶质体承载着多种独特的代谢途径，包括II型脂肪酸合成（FAS II）和甲基赤藓醇磷酸（MEP）通路，这些途径在宿主中不存在，因此成为抗寄生虫药物的理想靶点。

在顶质体中，植物型铁氧还蛋白（plant-type ferredoxin, ptFd）及其氧化还原伴侣——植物型铁氧还蛋白-NADP⁺还原酶（ptFNR）构成的氧化还原系统，负责向MEP通路最后两个酶（IspG和IspH）提供电子。MEP通路负责合成类异戊二烯的前体物质异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），这些是许多必需代谢物的构建模块。由于该通路在寄生虫中的不可或缺性以及在宿主中的缺失，针对MEP通路及其相关氧化还原系统的药物开发具有广阔前景。

然而，研究顶复门寄生虫MEP通路面临诸多挑战。许多相关酶（如IspG和IspH）是含有对氧敏感的[4Fe-4S]簇（4-ISC）的蛋白质，需要在无氧条件下进行体外研究，这对实验设备和技能提出了较高要求。此外，在寄生虫中进行反向遗传学操作耗时漫长，尤其是在疟原虫中，获得稳定克隆可能需要数周时间。因此，开发一种易于操作、能够模拟顶质体MEP通路功能的替代系统，对于快速筛选抑制剂和研究功能突变具有重要意义。

为了解决这些问题，研究人员在《Journal of Biological Chemistry》上发表了一项研究，他们成功在大肠杆菌中重构了顶复门寄生虫的铁氧还蛋白-MEP通路，建立了一个用于原位筛选抑制剂和必需酶突变的新型平台。

本研究采用了几项关键的技术方法：首先，利用同源重组技术构建了大肠杆菌双突变株（EcΔispHΔfldA），并通过引入甲羟戊酸（mevalonate, Mev）旁路途径实现对其生长的可控调节；其次，应用了基因组整合技术（如CRIM系统）将顶复门来源的ptFNR基因稳定插入大肠杆菌基因组；第三，通过分子克隆构建了多种诱导型表达载体，用于表达寄生虫来源的缩短版IspH、Fd及其突变体；第四，利用蛋白质免疫印迹（Western blot）和免疫荧光显微镜技术验证了重组蛋白的表达与定位；第五，采用靶向液相色谱-质谱（LC-MS）分析方法对MEP通路代谢物进行了定量检测；最后，通过在弓形虫中进行基因敲入和斑块分析实验，验证了在大肠杆菌模型中获得的表型。

Apicomplexan ispH complements E. coli ΔispH strain

研究人员首先测试了顶复门寄生虫来源的IspH能否互补大肠杆菌ΔispH菌株。他们使用了先前描述的MGΔLy菌株，该菌株在ΔispH背景下含有一个阿拉伯糖诱导的、基因组整合的EcispH拷贝。当去除阿拉伯糖并添加葡萄糖（用于分解代谢抑制）时，MGΔLy只能通过反式提供功能性IspH蛋白才能生长。研究人员表达了N端截短、6×His标签化的PfIspH和TgIspH蛋白，并发现这些蛋白能够有效互补MGΔLy的生长缺陷，表明它们在大肠杆菌中具有功能活性，且EcFldA或其他氧化还原蛋白能够作为顶复门IspH的电子供体。

E. coli flavodoxin is the electron donor required for the complementation of EcΔispH with apicomplexan ispH

为了确认EcFldA在互补过程中的作用，研究人员在MGΔLy中敲除了EcFldA基因，构建了EcMP2菌株。该菌株在阿拉伯糖存在下无法生长，表明FldA在向IspH传递电子过程中不可或缺。当在EcMP2中表达PfIspH或TgIspH时，在没有EcFldA的情况下，即使诱导寄生虫IspH的表达，也无法观察到细菌生长，进一步证实了EcFldA作为顶复门IspH电子供体的必要性。

Apicoplast Fd/FNR redox system and PfIspH can rescue EcMP2 growth

研究人员进一步测试了顶复门来源的Fd和FNR能否替代EcFldA的功能。当单独表达PfFd时，EcMP2无法生长，但共表达PfFNR后，菌株恢复了生长能力。这表明PfFNR与PfFd之间的特异性相互作用是不可替代的，两者在缺乏EcFldA的情况下是互补所必需的。研究人员将含有PfFNR、PfIspH和PfFd的菌株命名为EcMP2-FHF，并将其作为后续筛选平台。

Some mutations in the interaction interface between PfFd and PfIspH lead to growth arrest of EcMP2-FHF

作为概念验证，研究人员利用EcMP2-FHF菌株测试了PfFd中特定氨基酸突变对生长的影响。他们基于AlphaFold 3和Chai-1的预测模型，选择了可能参与蛋白互作（PPI）的氨基酸进行丙氨酸（Ala）替换。生长实验表明，某些突变（如R40A、D60A、D65A和C端缺失）会导致菌株生长停滞，而其他突变（如T46A、S62A、Y63A和Y80A）则对生长没有显著影响。这些结果验证了EcMP2-FHF作为筛选平台的实用性，可用于识别影响电子传递的功能突变。

Metabolic changes of the PfFd mutants reflect their impaired growth phenotype in E. coli

通过LC-MS分析MEP通路代谢物，研究人员发现，在导致生长缺陷的PfFd突变体中，中间代谢物MEcPP和HMBPP相对积累，而终产物DMAPP/IPP水平下降，这与IspG和/或IspH功能受阻的预期一致。非必需突变体的代谢谱则与野生型类似，进一步证实了生长表型的可靠性。

PfFd_mut phenotypes can be validated in the apicoplast of T. gondii

为了验证大肠杆菌模型中的发现，研究人员在弓形虫中表达了野生型和突变型PfFd。通过免疫荧光显微镜确认了这些蛋白在顶质体的正确定位。斑块分析表明，野生型PfFd能够互补弓形虫Fd敲低菌株的生长缺陷，而必需突变（如R40A、ΔC-term和C44A）则无法互补，表型与大肠杆菌模型一致。这进一步证实了该模型在预测顶质体内功能突变方面的有效性。

Shared amino acids between E. coli and P. falciparum proteins involved in PfFd PPI

研究人员通过结构建模分析了PfFd与互作蛋白（PfFNR、PfIspG和PfIspH）的界面氨基酸。发现一些关键氨基酸（如R40、C44和H96）与所有三种蛋白都可能发生相互作用，而D60和D65则主要与PfFNR和PfIspG互作。这些发现强调了这些氨基酸在电子传递中的重要性，但无法确定具体是哪一互作导致了功能丧失。

本研究成功构建了一个基于大肠杆菌的筛选平台，用于研究顶复门寄生虫MEP通路及其氧化还原系统的功能。该平台不仅能够模拟顶质体内的电子传递过程，还可用于筛选靶向这一通路的抑制剂和功能突变。研究人员验证了顶复门IspH、Fd和FNR在大肠杆菌中的功能性表达，并通过突变分析识别了PfFd中参与蛋白互作的关键氨基酸。这些发现为开发新型抗寄生虫药物提供了重要工具和理论基础。

该研究的优势在于其模块化设计，允许快速测试不同组合的蛋白质和突变体，从而加速对顶复门代谢通路的理解。此外，通过结合代谢组学分析和寄生虫验证实验，研究人员确保了模型的可信度和适用性。未来，这一平台可用于高通量筛选化合物库，识别特异性抑制剂，从而推动抗疟疾和抗弓形虫病药物的开发。