基于混合模式固定相柱前衍生化实现1-甲基色氨酸对映体分离及其在大鼠体内手性翻转的体内评价研究

　　本研究针对1-甲基-D-色氨酸(D-MT)体内手性转化机制不明确的问题，通过开发(R)-CIMa-OSu柱前衍生化结合混合模式色谱-LC-MS/MS的分析方法，成功实现D/L-MT的高效分离（分离因子α=1.44，分辨率Rs=6.14）。首次证实大鼠体内存在D-MT向L-MT的单向手性翻转现象，并证明D-氨基酸氧化酶(DAO)在该过程中起关键作用，为D-MT的临床药代动力学研究提供重要依据。

　　

在免疫治疗领域，1-甲基-D-色氨酸(D-MT)作为吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂备受关注，但其体内手性稳定性一直存在疑问。由于D型氨基酸在生物体内可能通过酶促反应转化为L型异构体，这种手性翻转现象可能导致药物代谢动力学特征改变和药理作用复杂化。尽管D-MT已进入联合抗癌药物的临床试验阶段，但其在大鼠体内28.7小时的半衰期数据与实际药理效应之间存在矛盾，提示可能需要重新评估其体内代谢过程。

为探究D-MT的体内手性转化行为，日本东邦大学药学部分析化学研究室的Mayu Onozato等研究人员在《Journal of Chromatography Open》发表了创新性研究成果。他们采用柱前手性衍生化结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的分析策略，使用实验室自主合成的(R)-CIMa-OSu(琥珀酰亚胺基-2-(3-((苄氧基)羰基)-1-甲基-5-氧代咪唑烷-4-基)乙酸酯)作为衍生化试剂，成功建立了D-MT和L-MT的高灵敏度分离检测方法。

关键技术方法包括：1)使用混合模式固定相Scherzo? SM-C18色谱柱实现衍生物的高效分离；2)通过(R)-CIMa-OSu柱前衍生化结合LC-MS/MS检测，监测特征碎片离子m/z 91.1；3)采用9周龄雄性Sprague-Dawley大鼠模型进行药代动力学研究；4)使用DAO抑制剂CBIO和MPC进行酶活性抑制实验。

3.1. D-MT和L-MT的对映体分离研究

研究人员比较了反相C18柱和混合模式色谱柱对CIMa-1-MT衍生物的分离效果。结果显示，混合模式固定相在70%B流动相条件下获得最佳分离效果，分离因子(α)达1.44，分辨率(R_s)为6.14，显著优于反相色谱柱的分离性能(α=1.29，R_s=2.69)。这种增强的分离能力归因于混合模式固定相同时具备的疏水作用和离子交换作用机制。

3.3. 大鼠血浆中D-MT和L-MT的时程变化

3.3.1. 大鼠血浆中D-MT和L-MT测定的验证

方法验证表明，D-MT和L-MT的校准曲线在1.56-12.5 μM和6.25-50.0 μM范围内呈现良好线性，相关系数分别为0.9999和0.9998。日内和日间精密度(RSD)均小于2.77%，准确度(RME)在±3.96%以内，证明方法可靠。

3.3.2. D-MT给药研究

口服给予大鼠25 mg/kg D-MT后，血浆中仅15分钟即可检测到L-MT生成，表明手性翻转迅速发生。D-MT在1.5-2小时达到最大血药浓度(C_max)，半衰期(t_1/2)为2.01±0.30小时，药时曲线下面积(AUC)为17.4±2.63 μmol·h/L。而L-MT的t_1/2长达20.1±1.88小时，AUC达242±37.9 μmol·h/L，说明L-MT在体内清除缓慢。

3.2.2. L-MT给药研究

口服L-MT后，血浆中未检测到D-MT，证实手性翻转是单向过程。L-MT的t_1/2为21.7±0.98小时，AUC高达1458±115.8 μmol·h/L，约为D-MT给药后产生L-MT的6倍，提示L-MT可能存在更高效的肠道吸收机制。

3.3. DAO抑制剂预给药的影响

预给予DAO抑制剂CBIO或MPC显著提高血浆D-MT浓度，CBIO组AUC增至36.7±3.23，MPC组增至60.7±3.61。同时，早期(0-4小时)L-MT的生成受到明显抑制，证实DAO参与D-MT向L-MT的转化过程。代谢途径推测为DAO首先将D-MT氧化为吲哚-3-丙酮酸，随后经转氨酶作用生成L-MT。

本研究通过创新性的手性衍生化LC-MS/MS分析方法，首次证实了大鼠体内D-MT向L-MT的单向手性翻转现象，并揭示了DAO在这一过程中的关键作用。这些发现不仅解释了先前文献中D-MT半衰期数据的矛盾，更为D-MT的临床药代动力学研究提供了重要启示。考虑到DAO在人体内同样存在，D-MT在人体内可能发生类似的手性转化，这一发现对D-MT的临床给药方案设计和药效评估具有重要指导意义。同时，研究建立的手性分离分析方法为其他手性氨基酸药物的代谢研究提供了可靠的技术参考。