AI辅助斑马鱼低磷酸酯酶症模型表型分析实现骨骼改变的早期精准检测

　　为解决低磷酸酯酶症(HPP)基因型-表型关联研究的挑战，研究人员开发了基于Vision Transformers(ViT)的AI模型，对新型转基因斑马鱼alplmue7品系进行骨骼表型自动化分类。该模型达到68.1%的准确率，较人工分类提升79%，成功识别早期发育异常并可视化决策聚焦区域（包括耳石结构），为HPP机制研究和药物筛选提供了 unbiased 的高通量表型量化平台。

　　

在遗传性代谢疾病研究领域，低磷酸酯酶症（Hypophosphatasia，HPP）因其高度异质性的临床表现和复杂的基因型-表型关联而备受关注。这种由ALPL基因突变引起的罕见疾病主要影响骨骼和牙齿矿化过程，患者可能表现出从致命性 perinatal 形式到轻度成人型的不同严重程度症状。尽管科学家们已经认识到组织非特异性碱性磷酸酶（Tissue Nonspecific Alkaline Phosphatase，TNAP）在调控羟基磷灰石沉积中的核心作用，但相同的ALPL变异在不同个体中可能导致截然不同的临床表现，这一现象至今无法得到合理解释。

传统动物模型研究面临显著挑战：小鼠模型仅部分重现人类HPP表型，而斑马鱼模型中使用吗啉代敲降或化学抑制方法又可能存在遗传补偿或脱靶效应。更棘手的是，即使采用高分辨率成像技术，人工评估斑马鱼骨骼结构的细微变化仍然存在主观性强和错误率高等问题。这种局限性严重阻碍了对HPP疾病机制的深入理解和治疗方法的开发。

为了解决这些难题，研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项创新性研究，他们通过结合转基因动物模型和人工智能技术，建立了全新的研究平台。研究人员首先通过CRISPR/Cas9基因编辑技术创建了稳定的alpl^mue7斑马鱼敲除品系，该品系缺失了alpl启动子和外显子1区域，模拟了严重HPP的疾病状态。随后，他们采集了97个斑马鱼幼虫的骨骼染色图像，包括神经颅和内脏颅在不同放大倍数下的显微镜图像，构建了包含901张图像的数据集。

关键技术方法包括：使用无酸阿尔新蓝和茜素红双染色技术可视化软骨和矿化组织；通过Keyence和ZEISS显微镜系统获取高质量图像；采用基于BEiT（Bidirectional Encoder representation from Image Transformers）的Vision Transformer架构进行图像分类；利用注意力 rollout 技术可视化AI决策过程；使用五折交叉验证评估模型性能。

Establishment and Investigation of alpl Knockout Zebrafish Line

研究人员成功建立了新型转基因斑马鱼品系alpl^mue7，通过CRISPR/Cas9技术删除了alpl基因启动子区域、外显子1以及部分5'UTR和内含子1-2区域，缺失片段达621bp。分子分析证实纯合子幼虫中alpl mRNA表达显著降低，而杂合子表达水平未见统计学显著变化，表明成功创建了模拟严重HPP的 loss-of-function 模型。

Defects in bone mineralization in alpl knockout larvae

通过对120 hpf（受精后小时）斑马鱼幼虫进行骨骼和软骨双染色，研究人员观察到矿化缺陷表型。然而，手动评估显示表型与基因型关联不可靠：70.8%的纯合子和51.3%的杂合子显示矿化改变，但27.7%的野生型也表现出类似变异，表明人工分类存在高度主观性和不可重复性。

AI-based classification shows significant genotype-phenotype correlations

深度学习模型显著优于人工分类，BEiT模型达到68.1%的整体准确率（AUC: 84.3%），较人工分类（38.0%准确率）提升79%。ResNet和ViT模型分别达到58.7%和52.9%的准确率。混淆矩阵显示误分类主要发生在杂合子与野生型或纯合子之间，反映了表型的连续性变化特征。

Attention-based visualization reveals biologically relevant decision-making in BEiT model

注意力可视化显示模型决策聚焦于生物相关区域：在神经颅中主要关注脊索和耳石（otoliths），在内脏颅中主要关注第五角鳃弓的牙乳头。值得注意的是，耳作为听觉和平衡器官的矿化部分，虽然不是骨组织，但成为模型关注的重点区域，暗示了HPP中可能存在的 previously unrecognized 矿化调节机制。

研究结论表明，AI辅助表型分析成功建立了HPP基因型-表型之间的显著关联，挑战了传统认为HPP高度异质性的观点。新开发的alpl^mue7斑马鱼模型为研究严重HPP提供了可靠平台，而注意力可视化技术揭示了模型关注耳石等非传统矿化结构，提供了新的生物学洞察。

这项研究的重要意义在于：首先建立了首个能够基于图像分析关联HPP骨骼表型与基因型的AI模型，为罕见病研究提供了新范式；其次开发了 unbiased 的高通量表型量化方法，可用于药物筛选和疗效评估；第三展示了可解释AI在生物医学成像中的价值，通过可视化决策过程发现新的生物学特征；最后为数据有限条件下的AI训练提供了成功案例，展示了迁移学习和精心策划数据集的有效性。

该研究不仅推动了HPP研究领域的发展，为治疗发现开辟了新途径，而且其方法学框架可扩展到其他骨骼疾病模型和物种，具有广泛的适用性和转化潜力。通过结合转基因动物模型和先进人工智能技术，研究人员为复杂遗传疾病的机制研究和治疗开发提供了强有力的整合平台。