益生菌与生物合成银纳米颗粒联合物理辐照对牛子宫内膜炎病原体的协同抗菌效应评估

　　本研究针对牛子宫内膜炎的传统治疗面临耐药性问题，开发了基于益生菌（Bacillus strains）、生物合成银纳米颗粒（AgNPs）及物理辐照（UV/IR/EMF）的创新疗法。研究发现G1益生菌组（Bacillus subtilis + Bacillus licheniformis）合成的AgNPs（5 mM）对E. coli抑菌圈达52 mm，IR+AgNPs组合使细菌计数降低75%以上。该研究为替代抗生素疗法提供了新策略，对畜牧业抗感染治疗具有重要应用价值。

　　

牛子宫内膜炎是一种常见的产后子宫疾病，由细菌感染引起，常导致流产等并发症，严重影响着牛的繁殖性能和生产力。其严重程度取决于细菌负荷、病原体毒力以及牛的免疫状态，风险因素包括代谢紊乱、异常分娩、胎次和胎盘滞留。近年来研究发现，怀孕子宫并非无菌环境，产后已鉴定出超过200种细菌物种。尽管细菌学检测可确认感染，但并不总是表明存在炎症。由于某些细菌对传统子宫内膜治疗方法表现出耐药性，探索替代疗法变得尤为迫切，这不仅因为该病症的重大影响，还因为牛群高感染率带来的经济后果。

益生菌是指人体内多样的微生物群落，在调节多种代谢过程中起着关键作用。特别是乳杆菌（Lactobacillus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、芽孢杆菌（Bacillus）和片球菌（Pediococcus）等菌株，通过抑制病原微生物，在宿主代谢和免疫防御中扮演重要角色。此外，益生菌细菌现在正被研究用于合成纳米粒子，以用于治疗应用。芽孢杆菌物种因其环境稳定性和功能特性（包括抗菌和抗氧化活性）而被广泛用于益生菌配方中。

如今，纳米粒子作为药物和营养输送系统、繁殖辅助手段以及抗菌替代品正受到越来越多的关注。金属纳米粒子，尤其是银纳米粒子（AgNPs），具有可调的光学特性、热稳定性和抗菌功效等优势。AgNPs对细菌、真菌、病毒以及抗生素耐药菌株均显示出强大的活性。虽然AgNPs可以通过物理、化学或生物方法合成，但由于传统技术的局限性，绿色合成更受青睐。

辐射类型如紫外线（UV）、红外线（IR）和电磁场（EMF）已确立不同程度的抗菌活性。紫外线辐射，特别是UV-C（200-280 nm），通过诱导DNA损伤、破坏复制和转录以及产生活性氧（ROS），能有效灭活微生物。微生物对UV的敏感性因物种、细胞壁组成和生理状态而异，革兰氏阴性细菌比革兰氏阳性细菌和真菌生物更易感。EMF，特别是低频场（如50 Hz），可以改变微生物的生长、存活率和抗生素敏感性，可能是通过诱导氧化应激或改变基因表达来实现。然而，结果好坏参半，效应可能取决于场强、暴露时间和微生物物种。IR辐射，特别是在近IR范围内，通过温和的热效应破坏蛋白质结构和细胞膜，显示出潜在的抗菌活性。此外，IR还能增强伤口愈合，调节炎症，并可能与其他治疗产生协同作用。

本研究旨在通过评估选定的商业益生菌、生物合成银纳米粒子以及各种类型辐射的抗菌潜力，来控制牛的微生物子宫内膜炎。此外，还研究了银纳米粒子与辐射对与该疾病相关的病原菌株的联合效应。

为开展本研究，研究人员采用了多项关键技术方法：从俄罗斯微生物保藏中心（VKM）获取了商业益生菌株和病原测试微生物；通过离心制备益生菌上清液并分组（G1-G7）；利用益生菌上清液生物合成AgNPs，并通过SEM/EDX、UV-Vis和FTIR进行表征；采用纸片扩散法测定抗菌活性；通过琼脂稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）；使用校准的UV、IR和EMF辐照装置处理病原体，评估其单独及与AgNPs结合的效应；通过平板计数法计算菌落形成单位（CFU/mL）；利用透射电子显微镜（TEM）观察超微结构变化；使用COSTAT软件进行统计学分析。

结果

标准抗生素纸片对病原菌株的抗菌活性

结果（表1）显示，研究中使用的细菌和真菌物种对传统抗生素敏感，从而验证了测试AgNPs和物理处理的实验设计。环丙沙星（Ciprofloxacin）表现出最广泛的抗菌活性，对测试细菌的抑菌圈为23-28 mm，而克霉唑（Clotrimazole）是最活跃的抗真菌剂（25-29 mm）。

七组益生菌对病原菌株的抗菌活性

如表2和图S1所示，G1显示出最强的活性（16.57±5.59 mm），尤其是对大肠杆菌（E. coli）（24 mm）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）（22 mm），并具有中等的抗真菌活性。G2也表现出强活性（14.43±5.38 mm），特别是对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌（S. aureus）和无乳链球菌（S. agalactiae）），但对真菌的效果较差。G3对革兰氏阴性菌没有活性，但显示出显著抗真菌效果，尤其是对白色念珠菌（C. albicans）（18.5 mm）。G4和G5显示出中等活性（11.57±1.51 mm和10.14±1.60 mm），主要针对大肠杆菌和铜绿假单胞菌，抗真菌影响很小。G6和G7表现出最弱的活性。

银纳米粒子的生物合成与表征

将AgNO₃（1-5 mM）与无细胞益生菌滤液混合后24小时内，颜色由黄色变为黄棕色，表明成功合成了AgNPs。纳米粒子的成功形成仅发生在G1和G4中。UV-Vis光谱（250-600 nm）证实了纳米粒子的合成，AgNPs-G1在425-450 nm处显示出一个尖锐的吸收峰，表明粒径均匀且稳定性良好（图1）。AgNPs-G4在475 nm处也显示出更宽的吸收峰（图2）。

SEM分析显示，AgNPs-G1呈球形，尺寸范围在63至290 nm之间。在1 mM AgNO₃下观察到较大的颗粒，而在5 mM的较高浓度下产生更小、更均匀的纳米颗粒（图3）。同样，AgNPs-G4大多为球形，在较低浓度下有一些聚集。尺寸范围从220到400 nm，随着AgNO₃浓度（5 mM）的增加而逐渐减小（图4）。研究发现，随着浓度的提高，两种AgNPs的尺寸都减小。因此，由于使用5 mM AgNO₃合成的AgNPs-G1平均粒径较小，故选择其进行进一步研究。

EDX分析（图5a）验证了银（Ag）是AgNPs-G1中的主要元素，按重量计占68.47%，按原子百分比计占24.83%。此外，还检测到碳（13.69% wt, 44.58% at）和氧（8.16% wt, 19.95% at）；它们可能来源于有机残留物或封端剂。微量元素Cl、Cu、Ca、S、P、Si、Al和Mg以痕量存在。AgNPs-G4的EDX光谱（图5b）证实了银的存在（41.98% wt, 8.67% at），确认了纳米粒子的形成。检测到高碳含量（36.12% wt, 66.98% at）和显著的氧水平（13.86% wt, 19.30% at）。还检测到微量元素氯、铝、硫和铜。FTIR光谱（图6）显示了七个吸收峰，分别位于3661.92、3443.59、2062.92、1633.02、629.82、564.99和463.88 cm^-1。这些峰对应于可能与纳米粒子封端和稳定相关的各种官能团的振动频率。

由(1-5) mM AgNO₃合成的AgNPs-G1的抗菌活性

结果显示出明显的浓度依赖性反应，平均抑菌圈从1 mM时的18.0±7.0 mm增加到5 mM时的44.29±7.55 mm（表3，图S2）。这种逐渐增加表明较高浓度的AgNPs导致更强的抗菌效果。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在最高浓度5 mM时表现出最高的敏感性，平均抑菌圈分别为38.6±10.6 mm和37.20±10.18 mm，而铜绿假单胞菌和无乳链球菌也反应良好，抑菌圈稍小。另一方面，真菌菌株表现出较低的敏感性。黑曲霉（A. niger）的平均抑菌圈最小，为21.0±9.9 mm，而白色念珠菌显示出中等反应，平均为24.70±10.95 mm。统计分析显示，五种AgNPs浓度之间的抗菌活性存在显著差异（P<0.001），而微生物菌株之间的差异无统计学意义（P1=0.055）。尽管未在alpha=0.05水平上达到完全显著，但存在变异趋势（p=0.055）。

由(1-5) mM AgNO₃合成的AgNPs-G4的抗菌活性

本研究结果表明，抗菌活性随着浓度增加而明显增加，抑菌圈从较低浓度（1 mM）时的6.07±5.73 mm增加到较高浓度（5 mM）时的18.07±4.38 mm（表4，图S3）。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在5 mM时表现出最大敏感性，平均抑菌圈分别为17.2±4.44 mm和16.0±3.95 mm。铜绿假单胞菌和无乳链球菌也显示出适度的抑制，平均抑菌圈从14.4±4.29 mm到15.7±4.84 mm。另一方面，真菌菌株在1-3 mM浓度下显示出较低的敏感性，未检测到抑菌圈。相反，在4 mM和5 mM时，出现了弱到中等的抗真菌活性。统计分析证实了不同AgNO₃浓度（P<0.006）和微生物菌株（P1=0.006）之间的抗菌活性存在显著差异。然而，AgNPs-G4显示的抗菌潜力低于AgNPs-G1的报告值，因此后续研究使用后者进行。

AgNPs-G1的最小抑菌浓度

仅对5 mM AgNPs-G1进行了MIC测定，因为它们具有增强的抗菌功效（表5）。大肠杆菌检测到最低MIC，为25,000 μg/mL，表明其与其他菌株相比对AgNPs更敏感。铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和白色念珠菌的MIC值稳定在50,000 μg/mL。另一方面，黑曲霉和烟曲霉（A. fumigatus）等真菌菌株表现出最高的MIC值，为100,000 μg/mL。

UV、IR和电磁场辐照对测试病原菌株抑制效果的评估程序

辐照处理后，通过平板计数法测定细菌/真菌细胞计数（CFU/mL）（表6）。与对照相比，单独使用AgNPs可使细菌CFU减少约50-75%，其中大肠杆菌减少75.1%，金黄色葡萄球菌减少51.3%。单独使用IR辐射可使细菌减少约33-63%，其中无乳链球菌减少63.4%。IR与AgNPs组合显示出最强的协同效应，对所有测试细菌的减少超过75%，其中金黄色葡萄球菌减少82.5%，无乳链球菌减少77.7%。

单独使用UV辐射效果较差，细菌减少5-43%（铜绿假单胞菌减少37.1%），但与AgNPs结合后效果增强（减少33.3%）。单独使用EMF可实现22%的减少，与AgNPs结合后提高到29%。无乳链球菌在使用IR与AgNPs组合时表现出最高的CFU减少（77.7%），其次是单独使用AgNPs（66.1%）和单独使用IR（63.4%）。单独使用UV和EMF分别导致43.4%和28.2%的减少，与AgNPs结合后分别增加到59.1%和42.3%。

对于白色念珠菌，最有效的治疗是IR与AgNPs组合，CFU/mL减少60%。单独使用AgNPs也显示出强活性，减少51.1%。单独使用IR辐射具有中等效果，减少35.6%。相反，单独使用UV辐射效果最差，减少20%，与AgNPs结合后略有改善（37.8%）。单独使用EMF使真菌数量减少33.3%，与AgNPs结合后增加到44.4%。在黑曲霉中，IR+AgNPs也显示出最高效果，减少74.1%，其次是单独使用AgNPs（63%）。单独使用IR实现38.9%的减少。值得注意的是，UV和EMF处理均产生不利影响：单独使用UV使真菌生长增加81.5%，与AgNPs结合后，真菌数量急剧增加237%。单独使用EMF导致57.4%的增加，与AgNPs结合后增加到201.9%。

在烟曲霉的情况下，IR+AgNPs再次实现最高的抗真菌活性，CFU减少77.1%，其次是单独使用AgNPs，减少47.9%。单独使用IR在IR基处理中效果最弱，减少22.9%。与黑曲霉类似，UV和EMF处理导致真菌生长增加：单独使用UV导致增加81.3%，与AgNPs结合导致增加264.6%。单独使用EMF导致35.4%的增加，EMF+AgNPs导致189.6%的增加。

透射电镜（TEM）分析

未经处理的细胞显示出均匀的微观结构、致密的细胞质和组织良好的细胞结构（图7a，图13a）。暴露于AgNP-G1、辐射或其组合的细胞显示出显著的形态学改变。所有测试菌株在IR和AgNPs处理后均显示细胞和分生孢子损伤。IR与AgNPs的联合处理效果最显著，导致严重变形，包括原生质体坍塌、细胞壁破坏和表面凹陷。在大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌中，单独使用AgNP-G1或IR处理引起轻微的细胞效应，表现为电子致密材料减少（图7b, 7c, 图8b, 8c, 图9c, 图10b和c）。此外，在用AgNP-G1处理的金黄色葡萄球菌细胞中注意到轻微伸长（图9b）。相反，用AgNP-G1+IR处理的大肠杆菌显示明显的细胞质收缩和细胞壁破裂（图7d），而铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌细胞形状不规则，具有大而空的中央区域（图8d, 9d）。无乳链球菌细胞显示电子密度降低和细胞壁破坏（图10d）。

在白色念珠菌中，单独使用AgNP-G1或IR处理导致异常细胞形态和细胞质收缩（图11b, 11c），而AgNP-G1+IR联合处理导致严重的细胞损伤，包括细胞内内容物泄漏和完全的结构变形（图11d）。用AgNP-G1、IR或其组合处理的黑曲霉和烟曲霉细胞显示异常形态、细胞质收缩，以及在烟曲霉的情况下，细胞内成分泄漏（图12b-d, 13b-d）。尽管在暴露于UV和EMF后，两种真菌物种的细胞计数意外增加，无论是单独使用还是与AgNPs结合，这些处理都对分生孢子造成实质性损害，表现为细胞壁坍塌和表面凹陷（图14, 15）。

讨论与结论

本研究揭示了七个益生菌组之间抗菌活性的显著变异性。例如，含有 Bacillus subtilis VKM B-2287 和 Bacillus licheniformis VKM B-2414 的 G1 显示出最高的抑菌圈，尤其是对大肠杆菌和铜绿假单胞菌，强调了其作为对抗革兰氏阴性和多重耐药菌管理工具的潜力。G2 的强抗菌活性，特别是对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌，证实了芽孢杆菌物种的广谱功效。G3 仅由蜡样芽孢杆菌（B. cereus）组成，对革兰氏阴性菌无效，但对白色念珠菌具有显著抗真菌活性，这可能是由于其产生抗真菌脂肽。混合组如 G4 (G1+G3) 和 G5 (G2+G3) 表现出中等活性，表明组合菌株并不总能提高有效性，并可能存在竞争相互作用。G6 和 G7 的抗菌活性最低，它们包含最多样化的组合，表明更大的菌株多样性不一定能抑制抗菌代谢物的产生。

银纳米粒子的成功合成由益生菌培养物暴露于硝酸银后颜色变为黄棕色表明，这是纳米粒子形成的既定视觉标志，归因于表面等离子体共振（SPR）现象。在生物合成中，只有益生菌菌株 G1 和 G4 能够合成 AgNPs，而所有其他菌株都不能生产。这种菌株选择性可能是由于两种滤液在组成和物理化学环境上的菌株特异性细胞外差异。UV-Vis 光谱显示 AgNPs-G1 在 425 nm 处有一个强烈而宽的吸收峰，这与球形银纳米粒子的 SPR 一致。SEM 分析证实了 AgNPs-G1 的球形形态，粒径范围在 63 至 290 nm 之间。随着 AgNO₃ 浓度的增加，观察到尺寸减小的趋势。EDX 分析验证了银是 AgNPs-G1 中的主要元素。红外光谱分析阐明了这些生物分子在纳米粒子封端中的作用。

本研究证明 AgNPs-G1 显示出强大且浓度依赖性的抗菌活性。在 5 mM AgNPs 下观察到最大抑菌圈，尤其是对大肠杆菌，甚至超过了标准抗生素。金黄色葡萄球菌也表现出高敏感性。真菌菌株，特别是白色念珠菌，对 AgNPs 表现出中等敏感性。AgNPs 改进的抗菌效果归因于它们能够与微生物细胞膜结合，增加通透性并引起结构损伤。较小的纳米粒子放大了这种效应。

MIC 是评估抗菌有效性的关键指标。在本研究中，AgNPs-G1 对大肠杆菌显示出最低的 MIC 值，表明其高敏感性，而黑曲霉和烟曲霉的敏感性最低。这些结果表明真菌病原体通常对 AgNPs 更具抗性，因为它们刚性的几丁质丰富细胞壁可以阻碍纳米粒子渗透。

红外辐射广泛应用于医疗疗法，并显著增强了生物合成 AgNPs 的抗菌效率。在我们的研究中，IR 与 AgNPs 组合对大多数菌株实现了超过 75% 的细菌减少，超过了 AgNPs 或 IR 单独的效果。这种效应归因于 IR 诱导的局部加热，改善了细胞膜通透性并刺激了纳米粒子的摄取，从而放大了细胞内的氧化应激。相反，UV 和 50 Hz 正弦 EMF 在 5 mT 下的辐射单独表现出有限的抗菌活性。特别是在真菌菌株黑曲霉和烟曲霉中；这些处理甚至似乎刺激了生长。UV 单独仅导致细菌存活率降低 5-43%，表明辐照剂量和暴露时间不足以诱导致命的 DNA 损伤。当 UV 辐射与 AgNPs 结合时，抗菌效力显著增加。与我们增强的细菌减少结果一致。与这些结果相反，我们显示真菌在混合 AgNP 和 UV 处理下生长更高。这是一种矛盾的反应，可能与 hormetic 反应有关。

暴露于电磁场可以在微生物中产生一系列细胞反应，以及改变的代谢、应激反应激活和潜在的基因突变。然而，50 Hz 正弦 EMF 在 5 mT 下单独并不是有效的抗真菌治疗，甚至似乎刺激真菌生长。虽然 EMF 与 AgNPs 的组合（EMF+AgNPs）与单独使用 EMF 相比增强了细菌减少，但明显不如 IR+AgNPs 组合有效。研究表明 EMF 暴露可以增加活性氧的产生，导致氧化应激和可能的遗传改变。此外，低频 EMF 暴露可以破坏膜完整性和离子通透性，影响微生物存活率。然而，EMF 也可能诱导适应性反应。关于暴露于 EMF 的丝状真菌的研究报告了酶活性、孢子形成和次级代谢产物产生的增加，表明生理适应。这可以解释我们研究中观察到的黑曲霉和烟曲霉生长增强。真菌可能激活应激反应或发生突变，以提高在 EMF 暴露下的存活率。

真菌生长通过 50 Hz 正弦 EMF 在 5 mT 和 AgNPs 的组合进一步增加，这表明两者之间存在复杂的相互作用。尽管有这种生长，用 AgNPs 结合 UV 或 EMF 处理的细胞的 TEM 显微照片显示细胞壁坍塌，表明细胞损伤。真菌数量的增加可能是由于它们利用辐射刺激代谢的能力；一种称为放射向性的现象，特别是在黑色化真菌中，它们已被证明在 UV 或电离辐射下茁壮成长，而不是被抑制。

总之，本研究确立了益生菌菌株、生物合成银纳米粒子及其与物理辐射源组合对一系列与子宫内膜炎相关的细菌和真菌病原体的抗菌潜力。G1 益生菌（包括 Bacillus subtilis VKM B-2287 和 Bacillus licheniformis VKM B-2414）在益生菌组中表现出最强的抗菌活性。生物合成的 AgNPs 显示出剂量依赖性的抑制效果，5 mM AgNPs 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌实现了最高的抑菌圈。IR+AgNPs 组合产生了最显著的抗菌功效，特别是对细菌病原体。相比之下，UV 和 50 Hz 正弦 EMF 在 5 mT 下的处理单独效果较差，并且当与 AgNPs 结合时，意外地促进了黑曲霉和烟曲霉的真菌生长。

最后，研制了一种阴道凝胶，含有由 G1 益生菌使用 5 mM AgNO₃ 合成的银纳米粒子，配合红外灯，在牛阴道粘膜上应用 10 分钟，以达到最大抗菌效果。不建议超过此时间的长时间暴露，因为过度的红外辐射可能导致不良反应。因此，建议控制应用时间为 10 分钟，以达到最佳治疗效果。