巴氏杀菌方法对早产儿肠道菌群的影响：Holder与Retort巴氏杀菌捐赠人乳的比较研究

　　本研究针对不同巴氏杀菌方法（Holder与Retort）处理的捐赠人乳（DHM）对早产儿肠道菌群的影响展开探讨。通过宏基因组学分析，发现Holder巴氏杀菌DHM喂养的婴儿肠道菌群α多样性更高（Chao-1 p=0.007），且有益厌氧菌（如Bacteroides thetaiotaomicron、Clostridium spp.）丰度更接近母乳喂养组。功能富集分析显示碳水化合物代谢、转运系统等通路存在显著差异。虽然短期临床结局（如NEC、BPD）无统计学差异，但研究首次揭示巴氏杀菌方法对早产儿肠道微生态的调控作用，为优化DHM处理工艺提供重要依据。

　　

当母亲自身乳汁不足时，早产儿通常需要依赖捐赠人乳（Donor Human Milk, DHM）作为营养来源。为确保安全性，DHM必须经过巴氏杀菌处理以灭活潜在病原体，其中Holder巴氏杀菌（62.5°C加热30分钟）和Retort巴氏杀菌（121°C高压加热5分钟）是两种最常用的工艺。然而，这两种方法对乳汁中生物活性成分（如免疫球蛋白、酶类、激素等）的破坏程度存在显著差异，且其对早产儿肠道菌群建立的影响尚未明确。肠道菌群在早产儿的免疫发育、代谢调节和疾病预防中扮演关键角色，尤其与坏死性小肠结肠炎（Necrotizing Enterocolitis, NEC）和支气管肺发育不良（Bronchopulmonary Dysplasia, BPD）等常见并发症密切相关。因此，探究不同巴氏杀菌方法对早产儿肠道菌群的影响，对优化临床喂养策略具有重要意义。

由于疫情期间Holder巴氏杀菌DHM供应短缺，范德比尔特大学医学中心（VUMC）新生儿重症监护室（NICU）于2019年12月至2022年3月期间使用Retort巴氏杀菌DHM，并于2022年4月切换回Holder巴氏杀菌DHM。这一独特的背景为研究者提供了天然的比较条件，使他们能够在同一NICU环境中，对比两种DHM喂养对早产儿肠道菌群及临床结局的影响。相关研究成果发表于《Pediatric Research》。

本研究主要采用以下关键技术方法：首先，前瞻性收集了VUMC NICU中胎龄<34周和/或出生体重<1500克早产儿的每周粪便样本（共457例婴儿），最终筛选出150例符合严格标准的样本（80例Retort组、54例Holder组、16例纯母乳喂养组）进行后续分析；其次，通过全宏基因组测序（whole-metagenome sequencing）技术，使用Illumina NovaSeq 6000平台对样本进行深度测序（平均每样本3000万条读长）；接着，利用VBAM软件进行序列组装、分箱（binning）和物种水平聚类（species-level clustering），并通过GTDB-Tk和CheckM进行物种分类与质量评估；最后，采用Phyloseq、ANCOMBC2等工具进行微生物组多样性分析、差异丰度统计以及功能富集分析（包括GO和KEGG通路分析），同时结合临床数据（如NEC、BPD、住院时长等）进行关联性检验。

研究结果

Alpha和Beta多样性分析

通过Chao1指数评估菌群丰富度，发现Holder组显著高于Retort组（p=0.007），但与母乳喂养组无显著差异。Shannon指数（衡量均匀度）在组间无统计学差异。Beta多样性分析（基于Bray-Curtis距离）显示，饮食类型（Holder、Retort、母乳）显著影响菌群结构（PERMANOVA p=0.017），分娩方式也对菌群组成有显著影响（p=0.001），而抗生素暴露和性别无显著影响。

taxonomic composition and differential abundance analysis

在门水平上，Retort组放线菌门（Actinomycetota）丰度较低，而厚壁菌门（Bacillota）丰度较高；Holder组则表现出最低的放线菌门丰度，但拟杆菌门（Bacteroidota）和部分厚壁菌门亚群（如Bacillota A、C）丰度增加。在属水平上，各组中最丰富的菌属包括克雷伯菌属（Klebsiella）、埃希菌属（Escherichia）、肠杆菌属（Enterobacter）等。物种水平差异分析（ANCOMBC2）显示，Holder组中Bacteroides thetaiotaomicron、Clostridium neonatale、Sarcina perfringens等有益厌氧菌丰度显著高于Retort组；而与母乳组相比，Holder组中双歧杆菌（如Bifidobacterium tsurumiense、B. bifidum）和乳酸杆菌（Lactobacillus gasseri）丰度较低。

临床结局比较

短期临床结局（如NEC、BPD、IVH、ROP、死亡率、住院时长）在Holder组与Retort组间无统计学差异。但母乳喂养组的早产儿视网膜病变（ROP）发生率显著低于两种DHM喂养组（0% vs. 24–34%, p=0.009）。

功能富集分析

GO富集分析显示，Holder组中与碳水化合物代谢相关的基因（如糖苷水解酶GH1、GH39家族，糖基转移酶GT4、GT5家族）以及转运系统（如ABC转运蛋白、磷酸转移酶系统PTS）显著富集。此外，双组分信号调节系统（如YesN/YesM）和HTH型转录调节因子也在Holder组中高度富集，表明其微生物组具有更强的环境适应与代谢调控能力。耐药基因分析显示，除氨基糖苷类6′-N-乙酰转移酶基因在Holder组中丰度较高外，其他耐药基因在组间无显著差异。

研究结论与意义

本研究首次揭示，DHM的巴氏杀菌方法显著影响早产儿肠道菌群的组成与功能。Holder巴氏杀菌法能够更好地保留乳汁中的生物活性成分，从而促进肠道菌群的丰富度及有益厌氧菌（如Bacteroides thetaiotaomicron、Clostridium spp.）的定植，使其更接近母乳喂养的菌群特征。功能上，Holder组菌群表现出更强的碳水化合物代谢能力和环境响应机制，这可能对早产儿的营养吸收和免疫成熟产生积极影响。尽管短期临床结局未发现显著差异，但菌群结构的差异暗示了长期健康风险的可能性（如NEC易感性）。此外，母乳喂养在预防ROP方面的优势提示DHM仍存在局限性。

该研究为临床选择DHM巴氏杀菌工艺提供了科学依据，建议在资源允许的条件下优先采用Holder巴氏杀菌法以优化早产儿的肠道微生态。未来研究需结合多组学技术（如代谢组、转录组）进一步探索菌群功能与宿主健康的机制，并通过大样本队列验证不同喂养策略对长期结局的影响。