组合式基因簇快速表征方法解析glidobactin生物合成机制并推动天然产物创新发现

　　本研究针对天然产物基因簇功能表征效率低下的难题，开发了一种新型组合式基因簇组装策略。研究人员通过系统性组合glidobactin生物合成基因，结合高通量质谱分析，成功鉴定出在E. coli BAP1中合成glidobactin A的最小基因集（glbBC-EFG），并同步获得多种具有潜在价值的类似物产生菌株。该方法为天然产物生物合成机制解析和工程化改造提供了高效技术平台。

　　

在天然药物开发领域，异源表达技术为可持续生产天然产物提供了重要路径。然而，基因簇中往往存在功能未知的基因，这使得确定产生目标分子所需的最小基因集变得异常困难。传统方法需要通过耗时的还原论技术（如原生生产者中的单基因或多基因敲除）来推断未知基因的功能，整个过程费时费力且效率低下。以glidobactin生物合成基因簇（BGC）为例，此前通过基因敲除研究得出的结果存在明显矛盾，不同研究团队对于哪些基因是必需的核心基因产生了分歧，这严重阻碍了对该基因簇的深入理解和工程化应用。

为了解决这一难题，研究人员在《Technical Innovations》发表了创新性研究成果，开发了一种快速组合组装方法用于基因簇表征，并成功阐明了glidobactin的生物合成机制。该研究通过巧妙的设计，将参与glidobactin生物合成的单个基因组合成部分或完整基因簇的集合，在异源宿主中进行表达，再结合质谱分析技术，最终确定了化合物生产所需的最小基因组合。

研究采用的关键技术方法主要包括：基于同源重组的组合基因簇组装技术（使用NEBuilder HiFi assembly master mix），通过精心设计的PCR引物实现在glbC和glbF基因两侧依次缺失基因的策略；高效液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析技术（Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF系统）；以及分子网络分析（通过GNPS平台基于MS/MS谱图相似性进行化合物聚类）。实验所用菌株S. brevitalea K481–B101（DSM 7029）来自DSMZ德国微生物和细胞培养物保藏中心。

3. Results and discussion

研究人员开发了一种基于同源性的组合重组方法，将glidobactin A基因簇的基因进行组合式重组。该方法设计了两种扩增子组，第一组覆盖glbBC基因，第二组覆盖glbDEFGH基因，设计方式使得基因可以从每组的上游或下游末端依次省略。通过这种策略，仅使用10个PCR扩增子就成功构建了11个质粒，转化至E. coli BAP1后获得了18个独特菌株，充分体现了该组装方法的组合优势。

对18个菌株的培养上清甲醇提取物进行LC-MS分析，并通过MS/MS谱图对齐创建了分子网络。研究发现所有菌株都能产生多种不同化合物，最明显的趋势是分为含glbB基因的菌株（产生glidobactin A及相关化合物）和不含glbB基因的菌株（产生luminmycin A及相关化合物）两大类。含有glbB的菌株glbBC-DEFG、glbBC-DEFGH、glbBC-EFG和glbBC-EFGH都能以glidobactin A（1）为主要产物，这证实了glbBC-EFG是在E. coli BAP1中合成glidobactin所需的最小基因集。

等效的不含glbB基因的菌株（glbC-DEFG、glbC-DEFGH、glbC-EFG和glbC-EFGH）都产生luminmycin A（2）作为次要产物，主要产物是luminmycin C（5）和线性全长产物luminmycin E（6）。在1产生菌株中缺乏等效线性产物表明环化1的硫酯酶结构域可能存在特异性。

4. Conclusions

该研究证实组合实验相比单个基因敲除具有更高的设计效率。组合组装方法使用10个扩增子构建11个质粒，创建了18个菌株，通过一次性创建一系列单基因和多基因敲除菌株，减少了获得目标菌株的实验轮次。重要的是，该方法不仅能够快速鉴定生物合成所需的最小基因，还能促进核心基因功能的阐明和有趣类似物的发现，如不含glbB基因的glbC-EFG菌株产生luminmycin A就证明了这一点。

确认生产glidobactin所需的最小基因集并同时产生类似物，突显了这种不需要事先了解单个修饰可能效果的方法优势。这样做避免了必须敲除单个基因，然后利用获得的信息逐个构建和测试目标菌株的困难。

该方法特别适合中小型基因簇，因为全面分析所需的菌株数量随着基因数量呈指数增长。研究人员在选择最佳方法时，需要考虑是采用更传统的筛选单个敲除菌株的方法，还是采用本文描述的这种强力组合生物合成方法。该方法的关键优势包括仅需单轮实验即可获得目标菌株，而不需要迭代敲除单个菌株，同时还能在一锅实验中创建产生替代产品的中间菌株。

虽然本研究以已知基因簇为例，但这项工作突出了组合基因簇组装作为表征新生物合成基因簇的有力工具的巨大潜力。该方法为天然产物生物合成机制研究提供了新的技术思路，特别是在基因功能不明确或存在争议的情况下，能够快速、系统地解析基因簇中各基因的功能和相互关系，为后续的工程化改造和优化奠定坚实基础。同时，该方法还能同步产生多种结构类似物，为药物先导化合物的发现和结构多样性拓展提供了新的技术平台。