解脂耶氏酵母细胞工厂从头合成聚(3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸)的工程化构建

　　本研究针对化学法生产维生素B6主要形式吡哆醇(PN)存在的环境污染问题，开发了结合DO-stat限制性混合碳源补料与两阶段压力控制发酵条件的整合策略，通过培养基优化使大肠杆菌PN产量达到3.33 g/L，为维生素B6的绿色生物制造提供了可靠且可放大的工艺方案。

　　

维生素B₆作为医药、食品添加剂和化妆品行业的重要化合物，其商业化主要形式吡哆醇(PN)目前主要通过化学合成法生产。然而，这种传统方法存在原材料消耗高、工艺步骤复杂以及严重环境污染等问题。随着绿色可持续发展理念的深入，开发高效、环保的微生物发酵策略替代传统化学合成法已成为研究热点。

在微生物发酵法生产PN的探索中，研究人员尝试了多种微生物宿主，包括大肠杆菌(E. coli)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和苜蓿根瘤菌(E. meliloti)等。其中，大肠杆菌因其清晰的遗传背景、丰富的遗传操作工具、较短的发酵周期以及天然存在的PN合成途径，被认为是生产PN的理想宿主。尽管通过代谢工程手段，包括启动子优化、酶融合和辅因子工程等策略，在一定程度上解决了PN合成途径的细胞内限制，但细胞外屏障——培养基的最优营养成分组成、最佳补料调控策略以及适当的氧传递效率——严重限制了生物反应器中的细胞生长和PN的高产量。

针对这些挑战，Chen Long等研究人员在《Technical Innovations》上发表了他们的最新研究成果，通过系统性的发酵过程优化，显著提高了PN的生物合成效率。

研究人员采用的关键技术方法包括：DO-stat限制性混合碳源补料技术，通过溶解氧水平实时调控碳源供给；两阶段压力控制发酵策略(0-24小时0.1 bar，24小时后0.2 bar)，根据不同发酵阶段的氧需求优化氧传递效率；Taguchi实验设计方法，系统优化培养基中关键组分(FeSO₄、MnSO₄、酵母提取物和蛋白胨)的浓度配比；以及基于HPLC的代谢产物分析技术，准确测定PN产量和发酵过程参数。

3.1. 不同补料策略对维生素B₆生产的影响

研究人员系统评估了四种补料发酵策略：低速率恒定补料、高速率恒定补料、指数补料和DO-stat补料。结果表明，DO-stat补料策略最为有效，能够实现最大OD₆₀₀70.5和最高PN产量1.116 g/L。这种策略不仅能有效防止混合碳源的过度积累，还能动态响应细胞代谢需求，实现碳供应与代谢活动的精确匹配。

3.2. 培养基组成的优化增强细胞生长和维生素B₆生产

在确定DO-stat补料为最优策略后，研究人员观察到大肠杆菌生长在34小时后开始进入平台期，表明发酵后期可能存在营养限制。通过单因素实验和Taguchi设计，研究人员系统优化了培养基组成，开发出新型生物反应器兼容发酵培养基CRS-67。在250 mL摇瓶水平上，优化后的CRS-67培养基将PN产量提高至639.99±21.48 mg/L，较初始CS培养基(364.00±7.89 mg/L)提高了约275 mg/L。

3.3. 通过限制性混合碳源补料和压力调控发酵协同增强维生素B₆生产

在5 L生物反应器规模上，研究人员发现了压力对PN生物合成的调控作用：低压(0.1 bar)有利于早期PN积累，而中等压力(0.2 bar)促进中后期持续生产。基于发酵阶段特性，建立了两阶段压力控制策略：前24小时保持0.1 bar，之后切换至0.2 bar。该策略显著提高了整体PN产量而不影响细胞生长，最终使OD₆₀₀达到142.8，PN产量达到3.33 g/L。

研究结论与讨论部分强调，该研究首次将DO-stat限制性混合碳源补料与压力调控控制相结合，用于增强大肠杆菌中维生素B₆(PN)的生产。通过系统研究不同补料策略对PN生物合成的影响，发现DO-stat补料最为有效，它能动态响应细胞氧需求并精确调控混合碳源。结合阶段特异性压力控制，该策略不仅促进了强劲的细胞生长，还显著提高了PN生产效率，为工业发酵过程提供了有前景且可扩展的解决方案。

最终结果表明，在这一系统优化策略下，OD₆₀₀达到142.8，最终PN产量为3.33 g/L，比先前报道的最高水平(2.12 g/L)提高了57%，平均生产率为45.0 mg/L/h，超过了先前报道的32.1 mg/L/h，最高生产率峰值达到111.8 mg/L/h，且成本更低。总之，该研究通过包括补料策略、培养基配方和发酵参数控制在内的全过程优化，实现了PN生物合成效率的显著提升，为PN的大规模工业生产奠定了坚实的技术基础和理论依据。

这项研究的重要意义在于它为解决微生物法生产PN过程中遇到的细胞生长限制和产量低下问题提供了全面解决方案，通过过程优化策略的创新性整合，实现了PN产量的显著提升，为维生素B₆的绿色生物制造产业化提供了可靠的技术路径。