副流感嗜血杆菌新型β-1,4-半乳糖基转移酶的鉴定及其在大肠杆菌中高效生物合成乳糖-N-新四糖的应用

　　本研究针对化学法合成吡哆醇(PN)存在的环境污染问题，通过DO-stat限制性混合碳源补料与两阶段压力控制发酵策略相结合，系统优化了大肠杆菌发酵培养基成分，成功将PN产量提升至3.33 g/L，创下目前最高纪录，为维生素B6的绿色生物制造提供了可规模化推广的高效工艺。

　　

维生素B₆作为医药、食品添加剂和化妆品领域的重要化合物，其商业化形式吡哆醇(Pyridoxine, PN)目前主要依赖化学合成法生产，但该方法存在高原料消耗、复杂工艺和严重环境污染等问题。微生物发酵作为一种绿色替代方案备受关注，然而菌体生物量低和产物效价不足严重制约其工业化应用。近年来，尽管通过代谢工程改造大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苜蓿中华根瘤菌(Ensifer meliloti)等微生物在PN生物合成方面取得一定进展，但这些菌种仍存在发酵周期长、遗传工具匮乏、依赖毒性前体添加等问题。大肠杆菌因其清晰的遗传背景、丰富的操作工具和天然PN合成途径成为首选生产菌株，但其发酵效价和生产效率仍待提升。

为解决工程菌在生物反应器中生长受限和PN产量不足的难题，本研究通过整合DO-stat限制性混合碳源补料、两阶段压力控制发酵条件和培养基优化策略，系统提升了大肠杆菌的细胞生长和PN生产能力。研究采用5升生物反应器进行分批补料发酵，通过PLC(可编程逻辑控制器)实时调控罐压，采用HPLC(高效液相色谱)配合荧光检测器分析产物，并运用Taguchi正交设计优化培养基组分。

2. Materials and Methods

关键实验技术包括：采用DO-stat补料策略动态调控碳源供给；通过两阶段压力控制(0-24小时0.1 bar，24小时后0.2 bar)优化溶氧水平；利用单因素实验和Taguchi三水平正交设计优化培养基中FeSO₄、MnSO₄、酵母提取物和蛋白胨的配比；使用生物传感器监测残余甘油和葡萄糖浓度；通过PID算法精确控制反应器压力波动范围在±0.01 bar内。

3. Results

3.1. Effects of different feeding strategies on vitamin B₆ production

通过对比四种补料策略发现，DO-stat补料(溶氧>50%时触发补料，<50%时停止)效果最优，使OD₆₀₀达到70.5，PN效价达1.116 g/L，能有效防止碳源积累并动态响应细胞代谢需求。

3.2. Optimization of medium composition enhances cell growth and vitamin B₆ production

通过单因素实验和Taguchi设计优化出CRS-67培养基，使摇瓶发酵PN产量提升至639.99±21.48 mg/L，较基础CS培养基提高275 mg/L。在5升反应器中验证显示该培养基使PN产量达1.50 g/L，但细胞生长(OD₆₀₀=40)受限。

3.3. Synergistic enhancement of vitamin B₆ production through restricted mix carbons feeding and pressure regulated fermentation

采用两阶段压力控制策略(0-24h 0.1 bar，24h后0.2 bar)显著提升发酵性能，最终OD₆₀₀达142.8，PN效价达3.33 g/L，生产效率达45.0 mg/L/h，最高生产效率达111.8 mg/L/h，较文献报道最高水平提升57%。

4. Discussion

本研究首次将DO-stat限制性混合碳源补料与压力调控策略相结合，通过系统优化培养基组分和发酵参数，实现了PN生物合成效率的显著提升。研究发现适度压力调控可通过影响细胞生理状态和代谢通量促进PN积累：早期低压利于底物吸收和氧传递，中期中压则引导代谢资源向PN合成途径倾斜。最终建立的集成策略为工业规模PN生产提供了可靠的技术方案，对维生素B₆的绿色生物制造具有重要推进作用。该研究成果发表于《Technical Innovations》期刊，为微生物发酵法生产高附加值化合物提供了创新性工艺范式。