通过限制性混合碳源喂养和压力控制发酵，在工程改造的大肠杆菌中增强维生素B6的产量

《Technical Innovations & Patient Support in Radiation Oncology》：Enhanced vitamin B 6 production in engineered Escherichia coli via restricted mix-carbon feeding and pressure-controlled fermentation

　　微生物维生素B6生产优化研究通过DO-stat混合碳源限制喂养和两阶段压力控制发酵条件，结合培养基优化，显著提升大肠杆菌中吡哆醇（PN）产量至3.33 g/L，突破现有最高水平。

　　维生素B6是生命活动中不可或缺的营养素之一，其多种衍生物如吡哆醇（PN）、吡哆醛（PL）和吡哆胺（PM）在医药、食品添加剂、饲料添加剂以及化妆品等领域具有广泛的应用价值。由于传统化学合成方法在原料消耗、工艺复杂性以及环境污染方面存在诸多问题，近年来，微生物发酵法作为绿色、可持续的替代方案逐渐受到关注。然而，尽管微生物发酵技术在理论和实验室层面取得了显著进展，其在工业化生产中的应用仍面临诸如菌体生长受限、产物浓度偏低等挑战。因此，如何通过优化发酵策略和培养基成分，提升微生物发酵效率，成为当前研究的重点方向。

本研究以大肠杆菌（*Escherichia coli*）为底盘细胞，系统地探讨了多种发酵策略与培养基优化对吡哆醇生产的影响。研究团队设计并实施了一种结合溶解氧（DO）统计控制（DO-stat）和混合碳源投加的策略，同时引入了两阶段压力控制的发酵条件，以提高细胞生长速率和产物产量。此外，还通过田口设计法对培养基成分进行了优化，以进一步提升发酵效率。研究结果表明，该集成策略在5升发酵罐中成功实现了细胞密度达到142.8（OD600）和吡哆醇产量达到3.33克/升，是目前报道的最高水平。这不仅为维生素B6的工业化生产提供了新的思路，也为微生物合成其他重要化合物奠定了基础。

在微生物发酵过程中，碳源的供给策略对细胞生长和产物合成具有关键影响。传统上，固定速率的碳源投加方式虽然操作简便，但难以满足细胞在不同生长阶段对营养的需求。因此，研究团队引入了DO-stat控制策略，该策略通过实时监测溶解氧浓度，动态调整碳源投加速率，从而实现对代谢需求的精准响应。结果显示，DO-stat控制策略能够有效防止碳源过量积累，避免代谢抑制，同时维持细胞生长所需的氧气供应。与固定速率投加相比，DO-stat策略在发酵过程中实现了更高的细胞密度和产物浓度。

除了优化碳源投加策略，研究团队还对培养基的组成进行了系统性调整。通过田口设计法，对关键成分如FeSO4、MnSO4、酵母提取物和蛋白胨进行了多因素优化实验。结果显示，酵母提取物和FeSO4对PN的合成具有显著促进作用，而MnSO4则有助于维持发酵过程的稳定性。蛋白胨虽然能够有效促进细胞生长，但对PN的合成影响较小。最终，通过优化这些成分的浓度，研究团队开发出一种新型的培养基CRS-67，其在250毫升摇瓶实验中表现出比原始培养基CS更高的PN产量，达到639.99毫克/升，比CS培养基提升了约275毫克/升。这一结果表明，通过系统性优化培养基成分，可以显著提高PN的合成效率。

在发酵过程中，氧气的供给是影响细胞代谢和产物合成的重要因素。研究表明，随着细胞密度的增加，氧气需求也会随之上升，而传统发酵罐的氧气供应能力往往难以满足这一需求。为此，研究团队引入了压力控制策略，通过调整发酵罐内压力，提高氧气的溶解度，从而缓解氧气限制问题。实验结果表明，当压力维持在0.1巴时，细胞生长和PN合成均表现良好，而随着压力的增加至0.2巴，PN产量进一步提升。然而，当压力超过0.2巴时，细胞生长和PN合成均受到抑制。这说明，在发酵过程中，压力的调控应根据细胞生长阶段进行分段控制，以实现最佳的氧气供应和代谢效率。

在此基础上，研究团队进一步提出了两阶段压力控制策略：前24小时维持低压力（0.1巴），以适应细胞在指数生长期的氧气需求；随后将压力提升至0.2巴，以满足PN合成阶段对氧气的更高需求。这一策略在5升发酵罐中取得了显著成效，最终实现了OD600为142.8和PN产量为3.33克/升的高水平产出。同时，研究还发现，通过精确控制碳源投加速率和压力水平，能够有效降低原料消耗，提高生产效率，并减少对环境的负担。

此外，研究还探讨了不同碳源投加策略对PN合成的影响。实验结果显示，低速率恒定投加、高速率恒定投加、指数投加和DO-stat投加四种策略在PN产量和细胞密度方面均表现出差异。其中，DO-stat投加策略在发酵过程中实现了最高的细胞密度（70.5）和PN产量（1.116克/升），表明其在动态调节碳源供应方面具有显著优势。相比之下，指数投加策略虽然能够模拟细胞在指数生长期的代谢需求，但在PN合成阶段的产量提升有限。高速率恒定投加虽然能够快速积累细胞，但容易导致碳源过量，进而引发代谢抑制。因此，DO-stat投加策略在实现细胞快速生长的同时，还能有效维持产物的高产量，是一种更为理想的碳源调控方式。

在实际应用中，培养基的优化同样至关重要。通过单因素实验和田口设计法，研究团队对培养基中的关键成分进行了系统评估。实验表明，酵母提取物和FeSO4的浓度对PN的合成具有显著促进作用，而MnSO4则有助于维持发酵过程的稳定性。蛋白胨虽然能够促进细胞生长，但对PN的合成影响较小。因此，在优化培养基时，应优先考虑对PN合成具有促进作用的成分，同时兼顾细胞的生长需求。最终，通过调整这些成分的浓度，研究团队成功开发出CRS-67培养基，该培养基在摇瓶实验中表现出优于原始培养基的性能，并在5升发酵罐中进一步验证了其有效性。

值得注意的是，压力控制策略不仅影响氧气供应，还可能对细胞的生理状态产生间接作用。在低压力条件下，细胞可能更倾向于维持基础代谢活动，而在高压力条件下，细胞可能通过调节代谢通路来适应环境变化，从而促进PN的合成。然而，压力过高可能会对细胞造成不利影响，抑制其生长和代谢效率。因此，研究团队在发酵过程中采用两阶段压力控制策略，既能满足细胞在不同阶段的氧气需求，又能避免压力过高对细胞的负面影响。

综上所述，本研究通过综合优化发酵策略和培养基成分，成功提升了大肠杆菌在发酵过程中对吡哆醇的合成能力。DO-stat投加策略与两阶段压力控制相结合，不仅提高了细胞生长速率和产物浓度，还为工业化生产提供了可行的解决方案。同时，培养基的优化进一步增强了发酵效率，降低了生产成本，并提高了产物的稳定性。这些成果表明，通过多维度的工艺优化，可以有效克服微生物发酵在工业化应用中的瓶颈问题，推动维生素B6的绿色生产模式向更高效率和更大规模迈进。未来，随着生物技术的不断发展，类似的优化策略有望应用于其他重要化合物的合成，为生物制造领域带来更广泛的应用前景。