FAP通过结合ITGB1激活PI3K/AKT通路促进口腔白斑恶性进展的机制研究

　　本研究针对口腔白斑（OLK）恶性进展机制不明的临床难题，通过体内外实验证实成纤维细胞活化蛋白（FAP）通过结合整合素β1（ITGB1）激活PI3K/AKT信号通路，显著促进OLK细胞增殖、迁移及癌变进程。FAP表达水平与OLK不典型增生程度呈正相关，其靶向干预可有效延缓恶性转化，为OLK早期诊断和靶向治疗提供了新理论依据和治疗靶点。

　　

口腔白斑（Oral Leukoplakia, OLK）作为最常见的口腔潜在恶性病变，犹如潜伏在口腔黏膜上的"白色幽灵"，虽看似平静却暗藏杀机。据统计，OLK患者发生口腔癌的风险显著高于普通人群，其病变进展遵循从轻度不典型增生（MI-OLK）、中度不典型增生（MO-OLK）、重度不典型增生（S-OLK）到原位癌乃至浸润性癌的多阶段模式。然而，驱动这一恶性转化过程的分子机制至今尚未完全阐明，这严重制约了早期干预策略的制定。就像无法预测哪片云彩会下雨一样，临床医生也难以准确判断哪些OLK病变会最终走向癌变，哪些将保持良性状态。这种不确定性不仅给患者带来沉重的心理负担，也给临床治疗决策带来巨大挑战。

近年来，科学家们将目光投向肿瘤微环境中的关键调控因子——成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast Activation Protein, FAP）。这个主要表达于成纤维细胞膜上的蛋白酶，因其在胶原降解、细胞迁移和组织重塑中的重要作用而备受关注。已有研究表明，FAP在多种恶性肿瘤中异常高表达，并通过激活丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）促进肿瘤恶性进展。但FAP在OLK这一癌前病变中的具体角色，却如同一个尚未解开的谜团。更令人好奇的是，FAP作为一个膜结合蛋白酶，其胞内段很短，它是如何将细胞外信号传递到细胞内的？这个问题的答案可能隐藏在FAP与其它膜蛋白的相互作用中。

之前的研究者Das等人通过测序技术发现，FAP在正常口腔黏膜、OLK和口腔鳞状细胞癌（OSCC）组织中存在差异表达，暗示其可能参与OLK进展。山西医科大学口腔医学院的研究团队在此基础上深入探索，他们推测FAP可能通过与整合素β1（Integrin β1, ITGB1）的相互作用，激活下游的PI3K/AKT信号通路，从而推动OLK的恶性进展。这一假设如同为解开OLK恶性转化之谜提供了一把钥匙。

为了验证这一科学假设，研究团队开展了一系列严谨的实验。在样本来源方面，他们收集了20例正常口腔黏膜、53例OLK（包括18例轻度、20例中度和15例重度不典型增生）和22例OSCC组织样本，所有样本均经山西医科大学口腔医学院组织病理学检查确诊。研究人员采用免疫组织化学技术检测了FAP和p-AKT在人类OLK和OSCC组织中的表达情况；通过细胞转染技术调控人异型增生口腔角质形成细胞（DOK）和人口腔鳞状细胞癌（SCC15）细胞系中FAP的表达；运用集落形成、细胞活力检测、Transwell迁移和划痕实验等功能实验评估细胞恶性行为；通过蛋白质印迹法分析ITGB1/PI3K/AKT通路相关蛋白表达；利用共免疫沉淀（Co-IP）和质谱分析鉴定FAP的相互作用蛋白；借助免疫荧光技术观察蛋白共定位；最后建立小鼠OLK模型，通过体内注射FAP敲低试剂，采用苏木精-伊红（HE）染色评估异型增生和OSCC的发生率，并通过免疫组化（IHC）检测FAP和p-AKT的表达。

研究结果首先揭示了FAP与OLK恶性程度的正相关关系。如图1所示，免疫组化结果显示OSCC组织中FAP和p-AKT的表达水平显著高于OLK组织。定量分析进一步发现，FAP和p-AKT表达随着OLK严重程度（从MI-OLK、MO-OLK到S-OLK）的增加而逐步升高。更令人振奋的是，基于FAP表达水平的ROC曲线分析显示，FAP在区分低风险组（正常口腔黏膜和轻度异型增生病例）和高风险组（中/重度异型增生病例）方面表现出卓越的判别能力（AUC = 0.92），这表明FAP有潜力作为评估OLK恶性转化风险的生物标志物。

在FAP介导DOK和SCC15细胞体外增殖部分，研究人员通过转染靶向FAP的siRNA或cDNA，成功敲低或过表达了FAP。CCK8实验数据表明，FAP敲低抑制了DOK和SCC15细胞的增殖，而FAP过表达则促进了两株细胞的生长。集落形成实验同样证实，si-FAP#1和si-FAP#2组的集落形成数量少于si-NC组，而通过LV-FAP转染实现FAP过表达后，集落形成率显著增加。这些结果一致表明FAP能够促进DOK和SCC15细胞的增殖能力。

关于FAP促进DOK和SCC15细胞体外迁移的研究发现，Transwell和划痕实验结果表明，与si-NC组相比，siFAP#1和siFAP#2组的迁移和侵袭能力显著受损。相反，FAP过表达增强了这些能力。划痕实验中，FAP敲低导致伤口闭合延迟，而FAP过表达加速了愈合过程。这些发现表明FAP促进细胞迁移和侵袭，从而增强了口腔鳞癌细胞的恶性行为。

在FAP调控OLK向OSCC体内进展的实验中，研究人员通过给C57BL/6小鼠饮用50μg/mL 4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）水溶液建立了小鼠模型。第26周时，宏观检查显示阴性对照组（siNC）比FAP敲低组（siFAP）的口腔病变更严重。口腔病变评分显示siNC组的评分显著高于siFAP组。组织病理学分析表明，siFAP组的小鼠异型增生和SCC数量均显著减少。免疫组化分析显示，siFAP组FAP和p-AKT染色的平均光密度显著低于siNC组，表明FAP抑制下调了p-AKT表达。这些体内结果证明，抑制FAP表达可降低p-AKT水平并延迟OLK向OSCC的进展。

最关键的发现在于FAP与ITGB1的结合及其通过PI3K/AKT通路促进OLK进展的机制。Co-IP联合质谱分析在DOK细胞中揭示，FAP与121个潜在结合伴侣发生物理相互作用，其中包括整合素β1（ITGB1）。免疫荧光染色证明FAP和ITGB1在DOK和SCC15细胞中共定位。Co-IP和蛋白质印迹进一步在两种细胞系中证实了这种相互作用。值得注意的是，用siFAP#1或siFAP#2敲低FAP降低了FAP和ITGB1的蛋白水平，而FAP过表达增加了它们的表达，表明FAP调控ITGB1的丰度。功能实验表明，ITGB1敲低减弱了FAP对DOK和SCC15细胞增殖和迁移的促进作用。蛋白质印迹分析显示，FAP沉默下调了ITGB1表达，并显著降低了PI3K和AKT的磷酸化水平，而不影响总PI3K或AKT蛋白水平。此外，LV-FAP和si-ITGB1的共转染表明，虽然FAP过表达增强了PI3K和AKT磷酸化，但这种效应在ITGB1敲低后被消除。总之，这些结果表明FAP与ITGB1结合，并通过激活PI3K/AKT信号通路促进DOK和SCC15细胞的恶性行为。

研究结论与讨论部分强调了本研究的理论与实践意义。该研究不仅证实了FAP和p-AKT表达水平与OLK病变严重程度呈正相关，更重要的是揭示了FAP通过结合ITGB1激活PI3K/AKT信号通路驱动OLK恶性进展的分子机制。这一发现为理解OLK恶性转化提供了新的理论框架，填补了癌前病变研究中FAP功能机制的空白。从临床转化角度，FAP表达水平作为区分低风险和高风险OLK的生物标志物具有重要应用价值，ROC曲线分析显示的0.92的AUC值表明其具有优异的判别能力。此外，体内实验证实FAP knockdown可显著降低小鼠模型中异型增生和癌变的发生率，这为开发靶向FAP的治疗策略提供了临床前证据。

然而，研究也存在一定局限性：样本类型仅限于OLK组织，未包含其他口腔潜在恶性病变；机制研究主要聚焦于PI3K/AKT通路，未全面探索FAP可能涉及的其他信号网络；缺乏临床随访数据限制了准确评估FAP预测价值的能力。这些局限也为未来研究指明了方向：扩大样本类型涵盖多样化的口腔癌前病变；探究多条信号通路的作用；建立长期随访队列进行临床验证。

该研究的发现具有重要的临床意义。FAP作为OLK恶性进展的关键驱动因子，其表达水平与病变严重程度正相关，使其成为评估OLK恶性转化风险的潜在生物标志物。针对FAP或ITGB1/PI3K/AKT信号通路的治疗策略可能延迟或预防OLK向OSCC的进展，为临床实践中精准医学策略的发展提供了有前景的途径。总之，这项研究不仅深化了对OLK恶性转化分子机制的理解，而且为开发新的诊断和治疗方法奠定了坚实的基础，最终有望改善OLK患者的预后和生活质量。