CRISPR/Cas9介导的uORF编辑技术显著提升丹参中丹参酮的生物合成

　　本研究针对丹参(Salvia miltiorrhiza)中丹参酮生物合成调控效率低的问题，通过CRISPR/Cas9技术精准编辑SmCPS1基因上游开放阅读框(uORF)，成功获得丹参酮含量显著提高的突变株系。研究证实uORF编辑通过增强SmCPS1蛋白翻译效率（而非转录水平）协调激活丹参酮合成通路关键基因表达，最高使总丹参酮积累量提升1.81倍。该研究首次在药用植物中建立uORF工程化平台，为次级代谢产物精准调控提供了新策略。

　　

丹参（Salvia miltiorrhiza）作为传统中药的重要原料，其根部分布的脂溶性丹参酮类化合物具有显著的心脑血管保护作用，市场需求持续增长。然而，传统育种方法难以实现丹参酮产量的精准提升，且过度依赖转基因技术可能导致代谢紊乱或农艺性状劣变。因此，开发既能保持植物优良性状又可高效增强目标代谢物合成的技术策略，成为药用植物分子育种的核心挑战。

近日发表于《Horticulture Research》的研究首次将CRISPR/Cas9介导的上游开放阅读框（Upstream Open Reading Frame, uORF）编辑技术应用于药用植物，成功调控了丹参酮生物合成中的关键二萜合酶基因SmCPS1的翻译效率，为药用植物代谢工程提供了新思路。

研究团队主要采用以下关键技术：基于生物信息学分析识别SmCPS1基因5′非翻译区（5′UTR）中的保守uORF；利用CRISPR/Cas9系统构建多重sgRNA编辑载体，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化获得丹参突变体；采用双荧光素酶报告系统（Dual-LUC）在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中验证uORF的翻译调控功能；借助超高效液相色谱-三重四极杆质谱（UHPLC-TQMS）定量分析丹参酮含量；通过实时定量PCR（qRT-PCR）和Western blot技术分别检测转录及翻译水平的变化。

Multiplexed CRISPR-Cas9 targeting for uORF knockout in SmCPS1

研究人员在SmCPS1的5′UTR区识别出5个类型1的uORF，其长度介于15–84 bp。通过双荧光素酶报告系统证明，同时突变5个uORF的起始密码子可使荧光素酶活性提高2.14倍，且不影响mRNA水平。利用CRISPR/Cas9系统构建了4条sgRNA，成功获得6株纯合突变体，从中选出4株（Del 1#–Del 4#）进行表型与机制分析。测序结果显示这些突变体在uORF区域存在不同形式的缺失和碱基替换，其中Del 2#与Del 3#中多个uATG密码子被破坏。

The uORF editing enhances tanshinone biosynthesis

代谢表型分析表明，Del 2#和Del 3#株系根部颜色显著加深，丹参酮提取液色泽更深。UHPLC-TQMS定量结果显示，Del 2#的总丹参酮积累量（TTA）达到5.11 mg/g（干重），较对照提高1.79倍；Del 3#提高1.81倍。Del 1#仅提高1.19倍，而Del 4#与对照无显著差异。四种主要丹参酮成分——丹参酮Ⅰ（Tan I）、丹参酮ⅡA（Tan IIA）、隐丹参酮（CPT）和二氢丹参酮（DHT）在Del 2#和Del 3#中均呈显著上升趋势。

SmCPS1 uORF mutation regulates the tanshinone biosynthesis genes

qRT-PCR分析表明，SmCPS1转录水平在突变体与对照间无显著差异，但关键通路基因表达出现协同上调。在甲羟戊酸（MVA）途径中，SmHMGR1和SmHMGR2在Del 2#和Del 3#中表达显著提高；SmIPPI在所有突变体中均有上调。下游基因中，二萜合酶SmKSL1及细胞色素P450基因SmCYP76AH1、SmCYP76AH3在Del 2#和Del 3#中表达提升最高达4.83倍，而SmCYP76AK1保持不变。表明uORF编辑通过提升SmCPS1翻译效率，间接激活了整个丹参酮生物合成通路。

研究结论表明，CRISPR/Cas9介导的SmCPS1 uORF编辑能够在不改变转录水平的前提下增强其蛋白质翻译效率，进而协同调控丹参酮合成通路中多个关键基因表达，最终显著提升丹参酮产量。该策略克服了传统过表达方法可能引起的代谢负担和基因沉默问题，首次在药用植物中实现了uORF工程化应用。

讨论部分强调，uORF编辑作为一种精细调控手段，具有可预测性强、不影响内源基因结构、易与多基因调控组合等优势。该研究不仅为丹参遗传改良提供了新材料，也为其他药用植物中高价值次生代谢物的合成调控提供了可推广的技术范式。未来可进一步拓展至转录因子或其他限速酶uORF的编辑，实现药用成分合成的多维优化。