基于雪貂模型鉴定甲型流感候选疫苗病毒减毒特性的临床与病毒学相关性研究

　　本综述系统分析了近20年流感候选疫苗病毒（CVV）在雪貂模型中的减毒特性，通过临床（体重减轻、发热）和病毒学（鼻腔冲洗液及组织病毒滴度）参数评估，揭示了CVV相较于野生型（WT）病毒在呼吸道复制受限、全身传播减少的显著减毒特征。研究建立了回归模型验证临床体征对病毒毒力区分的重要性，为CVV安全性测试标准化提供了关键数据支撑，极大优化了疫苗开发流程。

　　

引言

甲型流感病毒（IAV）在禽类和猪群中持续传播，对公共卫生构成持续威胁。流感候选疫苗病毒（CVV）的开发在全球流感大流行防范策略中扮演关键角色。CVV在雪貂模型中的减毒安全性测试是将其提供给疫苗制造商前的关键步骤。建立致病性标准对于设定可接受的疾病阈值至关重要，以便无需与亲本病毒比较即可评估CVV安全性。为评估不同CVV在哺乳动物宿主中的致病能力，本研究汇集了使用一致方法进行约20年CVV评估的临床和病毒学参数，以识别与野生型毒株相比最能反映减毒的疾病参数。

结果

IAV WT和CVVs在CDC的测试

CDC使用一致的实验方案进行IAV CVV测试已约20年，人畜共患亚型涵盖H1（包括2009年H1N1大流行病毒）、H2、H3、H5、H7、H9和H10，突显了对人类健康构成威胁的病毒多样性。除低致病性禽流感病毒A(H7N7) IBCDC-1（通过经典重配生成）外，表1所示的所有CVV均通过反向遗传学生成。CVV通常由源自A/Puerto Rico/8/1934 A(H1N1)（PR8）病毒的六个内部基因与来自目标野生型流感病毒的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因组合而成。对于H5或H7高致病性禽流感（HPAI）病毒，去除HA中对应多碱性氨基酸（MBAA）的序列以防止HA被普遍存在的细胞蛋白酶切割。为支持鸡蛋中的高产量（疫苗开发的典型方法），对表1中某些CVV引入了额外突变或修饰，这些均不会导致在哺乳动物细胞中获得功能。 collectively，使用反向遗传学与2:6 WT至PR8骨架配置代表了一种稳健、安全且一致的方法，用于快速生成CVV以支持大流行防范。

雪貂中IAV CVVs感染的临床体征

CVV在雪貂中通常表现出相对于亲本WT毒株减弱的感染临床体征，这主要归因于PR8病毒骨架的存在以及HA中MBAA切割位点的去除（如存在）。接种表1所列CVV的所有雪貂均存活感染，RG-PR8接种的雪貂也是如此，而许多HPAI亲本WT毒株报告了致死表型。此外，当雪貂接种CVV时，感染临床体征（包括嗜睡、腹泻、鼻腔分泌物、呼吸道和神经系统症状以及死亡率）的频率相较于匹配的WT病毒降低（图1）。然而，尚未进行系统评估以评估不同CVV面板的相对减毒程度。为此，我们汇总了表1所示病毒的数据，并比较了WT和CVV毒株之间关键临床参数的相对差异，旨在确定在CVV标准致病型评估期间记录的哪些参数相较于WT大幅降低。

发烧是雪貂中与人畜共患IAV感染相关的常见临床体征。此处包含的除一种外的所有WT病毒在接种后第1-9天（p.i.）的平均峰值温度>1°C，所有病毒相对于基线的中位升高为1.7°C（图2A）。CVV的平均峰值温度持续低于其配对亲本WT病毒（中位值0.8°C），仅一个例外（RG32A），但降低程度因亲本毒株而异，从0.1°C到2.0°C不等。WT和CVV组之间的平均峰值温度升高差异具有统计学显著性（P = 4e-8，表S1），进一步支持CVV在急性感染期间与可检测且有意义的热峰值读数降低持续相关。

体重减轻是实验室动物中评估发病率的常用参数。虽然亲本毒株表现出广泛的体重减轻（接近基线以下20%），但测试的所有CVV平均值均<6%，表明发病率普遍轻微（图2B）。与温度类似，减毒体重减轻的范围因毒株而异。尽管WT毒株中报告的最大体重减轻存在异质性，但WT和CVV组之间的平均差异具有统计学显著性（P = 1.3e-7，表S1）。将此分析限制在仅H5亚型病毒（包括A(H5N1)、A(H5N2)、A(H5N6)和A(H5N8)病毒）产生了与整个数据集相当的结果（表S2），支持这些临床参数的减毒在不同数据集中得以维持。

雪貂中IAV CVVs的病毒复制

PR8病毒骨架已知在雪貂中引起轻微疾病，尽管它可以在雪貂上呼吸道中适度复制直至p.i.第5天，肺部检测到的病毒水平极低。我们首先评估了配对WT和CVV在两种上呼吸道样本中病毒滴度的相对差异：鼻腔冲洗液（NW）（p.i.第1-7天平均峰值滴度）和鼻甲组织（p.i.第3天平均滴度）。除一对外，所有配对均观察到峰值NW病毒滴度的减毒，但减毒程度因毒株而异（图3A）。WT和CVV组之间的峰值NW滴度平均差异具有统计学显著性（P = 1.5e-3，表S1；图3A）。鼻甲病毒滴度的比较揭示了类似模式（图3B），组间均值和