低剂量丙戊酸通过EZH2/H3K27me3信号通路抑制铁蛋白自噬依赖性铁死亡改善骨质疏松症

　　本研究针对骨质疏松症中氧化应激与铁死亡的相互作用机制，探讨低剂量组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)的治疗潜力。研究发现100 mg/kg/d VPA通过激活EZH2/H3K27me3信号通路，表观遗传抑制NCOA4介导的铁蛋白自噬，恢复氧化还原稳态，显著改善OVX大鼠骨微结构和骨密度，为骨质疏松治疗提供了新的靶向策略。

　　

骨质疏松症（Osteoporosis, OP）作为一种常见的代谢性骨病，正成为全球性的重大公共卫生问题。其特征是骨微结构破坏和骨矿物质密度降低，过去二十年全球患病率高达18.3%，女性群体中甚至达到23.1%。目前临床主要依靠生活方式干预、钙/维生素D补充和抗骨吸收药物来延缓骨量丢失，但这些方法往往难以纠正深层的代谢失衡。

越来越多的证据表明，年龄相关的氧化应激在绝经后骨质疏松的发病机制中起着关键作用。雌激素缺乏会抑制线粒体脂肪酸β-氧化，导致活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）过度生成，包括超氧阴离子（O₂•^-）、过氧化氢（H₂O₂）和羟自由基（•OH）。持续的ROS积累会导致成骨细胞和骨细胞凋亡，损害骨矿化和形成。同时，氧化还原失衡还会促进破骨细胞分化，加速骨丢失和疾病进展。目前的抗氧化疗法受限于生物利用度差和缺乏特异性，迫切需要能够同时靶向氧化应激和下游细胞死亡通路（如铁死亡）的新型药物。

铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，不同于凋亡、坏死和自噬，其特征是铁驱动的脂质过氧化和谷胱甘肽耗竭。在骨代谢中，铁死亡通过损害成骨细胞活性和增强破骨细胞形成协同促进骨质疏松。NCOA4-FTH1轴的激活会引发铁蛋白自噬（ferritinophagy）——一种选择性自噬过程，通过降解铁蛋白释放Fe³⁺，随后还原为Fe²⁺，推动Fenton反应，形成加剧氧化应激和成骨细胞功能障碍的恶性循环。此外，Fe²⁺还通过RANKL/OPG轴刺激破骨细胞分化和骨吸收。

组蛋白甲基转移酶EZH2（Enhancer of zeste homolog 2）作为多梳抑制复合物2（PRC2）的催化亚基，通过催化组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3）来沉默基因表达。尽管该通路在癌症中调控铁蛋白自噬，但其在骨氧化还原稳态和铁死亡中的作用尚不清楚。

丙戊酸（Valproic acid, VPA）是一种具有八碳支链的脂肪酸，作为公认的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，因其高口服生物利用度（≥80%）和有效性，三十多年来一直被用作抗癫痫药物。除了神经学应用，VPA还通过表观遗传调控表现出多效性作用，包括抗炎和抗氧化活性。然而，VPA对骨骼的影响存在争议。长期高剂量VPA与骨吸收增加和骨折风险升高相关，可能源于成骨细胞功能受损和矿物质代谢紊乱。相反，先前研究表明，在特定浓度下，VPA能够增强成骨细胞分化并减轻骨细胞的氧化损伤。

基于这些背景，顾一凡等研究人员在《Free Radical Biology and Medicine》上发表了题为"Low-dose valproic acid ameliorates osteoporosis by restoring redox homeostasis and suppressing ferritinophagy-dependent ferroptosis via EZH2/H3K27me3 signaling"的研究论文，系统探讨了低剂量VPA通过靶向氧化应激和铁死亡对抗卵巢切除（OVX）诱导的骨质疏松的保护作用及机制。

研究人员采用的技术方法主要包括：使用OVX大鼠模型进行体内实验，通过micro-CT扫描分析骨微结构，采用生化试剂盒检测血清氧化应激指标（MDA、SOD、GSH、Fe²⁺）和骨代谢标志物（PINP、CTX-I）；利用MC3T3-E1成骨细胞系进行体外实验，通过CCK-8法和Calcein-AM/PI双染色评估细胞活力，JC-1染色检测线粒体膜电位，BODIPY探针检测脂质过氧化，透射电镜观察超微结构；采用蛋白质印迹分析关键蛋白表达，染色质免疫沉淀（ChIP-PCR）分析组蛋白修饰，分子对接预测VPA与EZH2的结合模式；通过TRAP染色评估破骨细胞分化。

研究结果方面，3.1小节显示：低剂量VPA（100 mg/kg/d）治疗显著改善了OVX大鼠的骨小梁结构和骨量，增加了骨矿物质密度（BMD）、骨体积（BV）、骨体积分数（BV/TV）和小梁数量（Tb.N），同时减少了小梁分离（Tb.Sp），而高剂量VPA（300 mg/kg/d）没有保护作用。

3.2小节表明：OVX诱导了系统性氧化应激（MDA和Fe²⁺升高，SOD和GSH降低）和铁死亡激活（ACSL4和NCOA4上调，GPX4和FTH1下调）。低剂量VPA逆转了这些变化，恢复了氧化还原稳态，并抑制了骨高转换状态。

3.3小节证实：在体外，1 mM VPA预处理减轻了Erastin诱导的MC3T3-E1细胞毒性、氧化应激、脂质过氧化和线粒体损伤，恢复了细胞活力和线粒体功能。

3.4小节发现：VPA通过下调NCOA4表达和上调FTH1表达，抑制了Erastin诱导的铁蛋白自噬依赖性铁死亡，改善了自噬流（SQSTM1和LC3B-II积累减少）。

3.5小节阐明了机制：VPA激活了EZH2/H3K27me3表观遗传通路，增强了H3K27me3在NCOA4启动子区的富集，从而抑制NCOA4转录。分子对接预测VPA与EZH2的SET结构域具有良好结合（结合能为-6.4 kcal/mol）。使用EZH2抑制剂GSK126可逆转VPA的保护作用。

3.6小节证明：VPA在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化和NFATc1表达，在体内减少了OVX骨组织中TRAP阳性破骨细胞数量。

讨论部分强调，本研究的主要发现是低剂量VPA通过恢复系统和局部骨氧化还原稳态，并特异性抑制成骨细胞中铁蛋白自噬依赖性铁死亡，从而减轻OVX诱导的骨质疏松。研究揭示了一个先前未充分表征的表观遗传通路——EZH2/H3K27me3介导的NCOA4抑制——作为低剂量VPA抑制铁蛋白自噬的核心机制，从而打破OVX诱导的铁过载、脂质过氧化和成骨细胞功能障碍的恶性循环。数据突出了VPA对骨骼作用的剂量依赖性双重性：高剂量VPA不仅不能逆转骨丢失，反而加重病情，而低剂量VPA通过同时增强成骨细胞存活和抑制破骨细胞活性，发挥显著的骨骼保护作用。

该研究的临床意义在于，通过阐明低剂量和高剂量效应之间的对比，有助于解决关于VPA骨骼安全性的持续争论。长期服用高剂量VPA（如用于癫痫治疗）与骨折风险增加相关，这归因于甲状旁腺功能亢进或线粒体毒性。本研究确定的骨保护剂量（大鼠100 mg/kg/d）基于体表面积换算相当于人等效剂量（HED）约16 mg/kg/d，远低于癫痫治疗中使用的剂量，如果结合靶向递送系统（如骨归巢纳米颗粒或水凝胶），可以显著降低系统性毒性问题。

这些发现将低剂量VPA定位为一种有前景的靶向氧化还原疗法，特别适用于具有潜在氧化应激的患者群体，如绝经后妇女和糖尿病患者。研究不仅重新定义了VPA在骨代谢中的作用，建立了铁死亡的表观遗传调控作为一个有前景的治疗靶点，而且重新定位低剂量VPA作为管理氧化还原失衡骨质疏松的可行策略。