传统中药来源新型造血前列腺素D合酶抑制剂的发现与表征：二氢小檗碱治疗杜氏肌营养不良和炎症相关疾病的生物活性潜力

　　本研究发现传统中药（TCM）来源的二氢小檗碱（EMy-5）是一种高效、高选择性的造血前列腺素D合酶（H-PGDS）抑制剂（IC50?=?3.7?μM；KD?=?3.2?μM），通过π-π堆积、氢键和疏水作用稳定结合酶活性中心，显著抑制KU812细胞中前列腺素D2（PGD2）的产生，且无细胞毒性，为治疗杜氏肌营养不良（DMD）及炎症过敏性疾病提供了新型候选药物。

　　

Abstract

炎症在各种疾病中扮演核心角色，因此亟需有效的抗炎药物。前列腺素D₂（PGD₂）是由造血前列腺素D合酶（H-PGDS）合成的关键介质，与过敏和炎症性疾病密切相关。本研究采用基于药效团的筛选方法，以识别靶向H-PGDS的抑制剂。模型Phar-A2HR2鉴定出EMy（IC₅₀?=?88.9?±?1.1?μM）为潜在抑制剂。进一步分析显示，其类似物EMy-5（二氢小檗碱）表现出最强的抑制活性（IC₅₀?=?3.7?±?1.1?μM）和结合亲和力（K_D?=?3.2?±?0.74?μM）。分子动力学模拟揭示了H-PGDS-EMy-5复合物中的稳定相互作用，包括π-π堆积、氢键和疏水接触。功能性实验证实，EMy-5显著降低了KU812细胞中PGD₂的产量。这些发现凸显了EMy-5作为治疗炎症和过敏性疾病（包括杜氏肌营养不良）的有前途的候选药物，展示了其强大的抑制活性和结合特性。

Introduction

炎症是一种由有害刺激、感染或组织损伤触发的复杂生理反应，是免疫系统防御机制的重要组成部分。这一多方面的过程旨在消除有害因子，防止进一步损伤，并启动组织修复和愈合。虽然炎症对于维持体内平衡至关重要，但失调或慢性炎症是许多疾病发病机制的基础，包括类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和哮喘，这些疾病共同影响着全球数百万人。因此，靶向炎症通路已成为旨在减轻疾病进展和缓解症状的治疗策略的基石。花生四烯酸衍生的前列腺素是调节炎症反应的关键脂质介质。其中，前列腺素D₂（PGD₂）是一种具有生物活性的酸性脂质介质，发挥多种生理和病理作用。PGD₂参与调节体温、激素分泌、嗅觉功能、睡眠周期和疼痛感知，此外还通过抑制血小板聚集发挥抗血栓活性。PGD₂的作用由两种不同的G蛋白偶联受体（GPCR）介导：DP1和DP2受体。DP2受体，也称为CRTH2（在Th2细胞上表达的趋化因子受体同源分子），在Th2相关的免疫反应中扮演核心角色。DP1受体主要在树突状细胞上表达，而DP2受体则存在于Th2细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞上。DP2受体的激活有助于嗜酸性粒细胞的趋化性，并是Th2介导的炎症过程（包括与过敏和炎症性疾病相关的那些过程）的关键驱动因素。

PGD₂通过两种不同的前列腺素D₂合酶亚型的催化活性合成：造血前列腺素D₂合酶（H-PGDS）和脂质运载蛋白前列腺素D₂合酶（L-PGDS）。这些酶在其组织分布和功能角色上有所不同。L-PGDS主要在心脏组织、睾丸和大脑中表达，在那里它有助于各种生理过程。相比之下，H-PGDS是一种谷胱甘肽依赖性酶，主要在炎症环境中催化PGD₂的合成，并在肥大细胞、抗原呈递细胞、巨核细胞和T辅助2（Th2）淋巴细胞中高度表达。H-PGDS属于谷胱甘肽S-转移酶（GST）的sigma（σ）类，并以显著的特异性催化环氧化酶衍生的PGH₂转化为PGD₂。这种特异性很大程度上归因于其催化结构域的独特结构特征，该结构域比其他GST家族成员通常观察到的活性位点更宽更深。这些结构特征不仅能够实现精确催化，而且还将H-PGDS区分为炎症信号通路中的关键介质。鉴于其在PGD₂产生以及随后促进Th2驱动的炎症反应中的核心作用，H-PGDS已成为管理过敏和炎症性疾病的一个有前途的治疗靶点。H-PGDS的抑制在临床前模型中已显示出显著的保护作用，特别是在过敏性气道炎症的小鼠研究中。这些发现强调了H-PGDS抑制剂的治疗潜力，它们为治疗哮喘、特应性皮炎和其他炎症相关疾病提供了有效的策略。

H-PGDS晶体结构确定的最新进展为理解酶-底物相互作用提供了关键见解，为合理设计H-PGDS抑制剂铺平了道路。大量研究和众多专利都集中在这些抑制剂治疗各种炎症性疾病的潜力上，包括过敏反应、哮喘和其他炎症相关疾病。几种抑制剂已被探索，例如TAS-204、TAS-205、HQL-79、KMN-698、HPGDS inhibitor I和TFC-007。其中，TAS-205在2018年进入I期临床试验，在23名杜氏肌营养不良男孩中进行了测试。尽管有这些发展，H-PGDS抑制剂的临床转化仍面临重大挑战。一个主要障碍是临床前动物模型和人体试验中观察到的药代动力学和药效学差异。这强调了超越传统H-PGDS抑制的创新治疗策略的必要性，以便进行更稳健的临床评估和应用。天然产物作为现代药物发现中的关键资源已获得越来越多的关注。这些天然来源提供了大量具有独特分子结构和药理特性的生物活性化合物，这些特性通常比合成药物具有更高的安全性和更少的副作用。它们的效用涵盖广泛的治疗领域，解决诸如慢性炎症、癌症和神经系统疾病等病症。随着整合医学继续获得关注，天然产物不仅因其在补充疗法中的作用而被认可，而且作为具有增强传统药物治疗效果和安全性潜力的新型化合物的储备库。鉴于这些优势，天然产物对于发现和开发新型H-PGDS抑制剂具有重大前景。

在本研究中，我们试图从传统中药（TCM）数据库中识别、表征和开发新型人H-PGDS抑制剂。为了实现这一目标，我们采用了一种综合方法，结合了基于药效团的抑制剂筛选、生化和生物物理分析、细胞实验以及分子模拟。我们发现并表征了二氢小檗碱（EMy-5），一种小檗碱衍生物，作为H-PGDS的高效抑制剂，H-PGDS是促炎介质PGD₂生物合成中的关键酶。通过对TCM数据库中的生物活性化合物进行全面筛选，EMy-5表现出卓越的抑制活性，其IC₅₀值为3.7 μM，超过了已知的H-PGDS抑制剂HQL-79的性能。此外，无标记局部表面等离子体共振（LSPR）分析证实了EMy-5与H-PGDS的强结合亲和力（K_D = 3.2 μM）。此外，分子对接和动态模拟研究显示，EMy-5通过氢键、π-π堆积和疏水力与H-PGDS活性位点的关键残基建立稳定的相互作用，形成一个结构稳定且能量有利的蛋白质-配体复合物。而且，EMy-5显著降低了KU812细胞中PGD₂的合成，同时在哺乳动物细胞上未显示细胞毒性作用，强调了其药效学功效和安全性。这些发现强调了源自食物、植物和草药中的小檗碱的EMy-5，可以作为开发针对PGD₂通路的创新抗炎和抗过敏疗法的有前途的来源，值得进一步的临床前和临床研究。

Materials and methods

Preparations of the recombinant H-PGDS protein

人H-PGDS表达质粒的构建涉及使用Clone EZ无缝克隆技术将合成的H-PGDS基因无缝整合到pET22(b)+载体中。基因合成及随后克隆到指定表达载体由Yao-Hong Biotechnology Inc.完成。得到的H-PGDS质粒被转化到大肠杆菌Shuffle T7 (DE3)（New England Biolabs）细胞中，并在含有50 mg/L氨苄青霉素（Sigma–Aldrich）的LB培养基（Sigma–Aldrich）中于37°C培养。当600 nm处的光密度（OD₆₀₀）达到0.6时，通过添加1.0 mM IPTG（Sigma–Aldrich）诱导蛋白质表达。诱导在24°C下进行18小时以优化蛋白质折叠。然后通过以6,000 rpm离心10分钟收获细胞，并重悬于含有20 mM Tris-HCl（Sigma–Aldrich）和150 mM NaCl（Sigma–Aldrich）（pH 7.4）的裂解缓冲液中。使用高压均质器（Constant Systems Cell Disruptor CF1）实现细胞裂解。裂解物经离心收集上清液，然后进行两步纯化过程。首先，采用镍-硝基三乙酸（Ni-NTA）亲和色谱（Qiagen, Hilden, Germany）捕获带有His标签的H-PGDS蛋白。随后使用Hitrap Capto Q柱（Cytiva Life Sciences, MA, USA）通过快速蛋白质液相色谱（FPLC）进行进一步纯化，确保高蛋白纯度。最终H-PGDS制剂的纯度通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色进行评估，证实了纯蛋白的生产。

Receptor–ligand pharmacophore generation and pharmacophore-based inhibitor screening (ligand pharmacophore mapping)

为了阐明配体与靶蛋白相互作用所需的关键特征，进行了受体-配体药效团建模。药效团模型是使用H-PGDS-喹啉-3-甲酰胺复合物（PDB ID: 6N4E）的晶体结构开发的。建模过程使用Discovery Studio 2021（Accelrys Software, Inc., San Diego, CA, USA）中的受体-配体药效团生成模块进行。在构建药效团模型时，H-PGDS结构作为“输入受体”，而喹啉-3-甲酰胺分子被指定为“输入配体”。参数配置为“最小特征”和“最大特征”分别设置为10和30，并且药效团的最大数量限制为10。对于构象生成，使用了“快速方法”与“刚性拟合方法”。所有其他参数均采用默认设置。生成的药效团模型随后用于配体-药效团映射，以根据定义的药效团特征识别潜在的抑制剂。共有1,500种来自传统中药（TCM）数据库（https://qatcm.nricm.edu.tw/key-components/）的化合物通过将它们拟合到药效团模型进行了筛选。该筛选使用了“柔性”拟合方法，而所有其他参数保持其默认值。

H-PGDS inhibition assay

采用FP-Based Inhibitor Screening Assay Kit-Green（Cayman Chemical, 600007）来量化筛选出的抑制剂对H-PGDS的抑制能力。所有测定均在黑色、非结合384孔板中进行，使用重组人H-PGDS蛋白、谷胱甘肽和荧光探针在确定的测定缓冲液中，每孔最终体积为47.5 μl。化合物在DMSO（Sigma-Aldrich）储备液中制备，并将2.5 μl每种测试化合物添加到相应的孔中以产生一系列化合物浓度。然后将板在室温下孵育1小时，以确保充分的结合相互作用。测量在Synergy H1MF酶标仪（BioTek Instruments, Inc.）上进行，激发和发射波长在荧光偏振模式下分别设置为470 nm和530 nm。每种化合物对H-PGDS的抑制效果基于mP值的变化计算，使用以下方程：抑制率% = (mP_100% ? mP_sample)/mP_100% ×100，其中mP_sample表示含有测试抑制剂的孔的荧光偏振值，mP_100%表示未添加抑制剂的孔的值。每个实验条件进行三次重复以进行稳健的统计分析。每种化合物的IC₅₀，定义为将mP降低50%所需的浓度，通过将mP值对化合物浓度的对数作图来估算，从而能够确定结合亲和力和效力。

Localised Surface Plasmon Resonance (LSPR)

使用OpenSPR仪器（Nicoya Lifesciences Inc.）进行局部表面等离子体共振（LSPR）测量，以评估人H-PGDS与抑制剂之间的结合相互作用。人H-PGDS通过交联共价固定在胺传感器芯片上。交联反应使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）（Sigma–Aldrich）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（Sigma–Aldrich），摩尔比为1.5:1.5:1，随后使用PD SpinTrap G-25柱（GE Healthcare Life Sciences）纯化H-PGDS-EDC/NHS复合物。PD SpinTrap G-25柱通过以800 × g离心1分钟，用400 μl 1× PBS（Sigma–Aldrich）平衡，弃去流出液。随后，将柱子转移到一个干净的收集管中，并将150 μl H-PGDS-EDC/NHS反应混合物小心地施加到填充树脂床的中心。通过以800 × g离心2分钟实现未反应试剂和H-PGDS-EDC/NHS复合物的分离，从而收集含有纯化蛋白溶液的洗脱液。所得样品用于下游应用。纯化的H-PGDS样品在1× PBS中稀释至50 μg/ml的浓度，并固定到传感器芯片表面。使用含有1% BSA（Sigma–Aldrich）的1× PBS溶液以20 μl/min的流速进行封闭，以最小化非特异性相互作用。对于测定测量，运行缓冲液切换为补充有2 mM MgCl₂（Sigma–Aldrich）和2 mM GSH（Sigma–Aldrich）的PBST（Sigma–Aldrich）。抑制剂最初制备为10 mM DMSO储备液，稀释到相同的PBST缓冲液中至不同浓度，并依次注射到固定的H-PGDS表面上。结合相互作用被实时监测以生成传感图，并使用TraceDrawer软件进行分析。动力学参数，包括解离速率常数（K_off）和结合速率常数（K_on），被计算并用于推导平衡解离常数（K_D）。该K_D值提供了H-PGDS与抑制剂之间结合亲和力的定量评估。

Cell culture

人胚胎肾293T（HEK293T）细胞系由Dr. Ming-Chuan Hsu惠赠。KU812细胞系购自台湾生物资源保存与研究中心（Bioresource Collection and Research Centre, Taiwan）。HEK293T细胞在补充有10% FBS（Sigma–Aldrich）、100 U/ml青霉素（Sigma–Aldrich）和0.1 mg/ml链霉素（Sigma–Aldrich）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中于37°C、5% CO₂环境下维持。当达到80%汇合度时，移除培养基，并用1× PBS洗涤细胞。然后用2 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA（Sigma–Aldrich）在37°C处理4分钟，使细胞从培养表面脱离。脱离后，通过加入2 ml含有10% FBS的DMEM（Sigma–Aldrich）终止反应，并以800 rpm离心3分钟使细胞沉淀。细胞沉淀重悬于4 ml含有10% FBS的DMEM中，并将细胞密度调整至每100 μl 5,000个细胞。随后将细胞悬液接种到96孔板中，并在细胞毒性测试前孵育24小时以允许贴壁。KU812细胞在RPMI-1640培养基（Sigma–Aldrich）中培养，该培养基补充有10% FBS、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素。细胞在37°C、含有5% CO₂的湿润气氛中维持。对于实验测定，将KU812细胞（5 × 10⁵个细胞）转移到含有0.1% FBS的RPMI-1640培养基中，并在玻璃管中孵育。细胞用一系列抑制剂浓度处理30分钟，然后用1 μM A23187（Sigma–Aldrich）刺激另外30分钟。孵育期后，细胞悬液在4°C以350 × g离心5分钟。小心地从离心管中收集上清液，用于定量测定PGD₂浓度。

Cytotoxicity

HEK293T细胞在补充有10% FBS（Sigma–Aldrich）、100 U/ml青霉素（Sigma–Aldrich）和0.1 mg/ml链霉素（Sigma–Aldrich）的DMEM（Sigma–Aldrich）中于37°C、5% CO₂气氛下培养。细胞以每孔5,000个细胞的密度接种于96孔板中，并孵育24小时以确保贴壁。此后，移除培养基，并用在新鲜DMEM（Sigma-Aldrich）中含有10% FBS的不同浓度的测试化合物处理细胞，分别再处理24和48小时。KU812细胞在RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich）中培养，该培养基补充有10% FBS、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素，并在37°C、湿润的含有5% CO₂的气氛中维持。对于细胞活力测定，将KU812细胞（5 × 10⁵个细胞）转移到含有0.1% FBS的RPMI-1640培养基中，并在相同培养条件下在玻璃管中用测试化合物分别处理24和48小时。处理后，对HEK293T和KU812细胞均进行结晶紫染色。弃去培养基，并用1× PBS洗涤细胞一次。通过向每孔或管中加入100 μl 0.1%结晶紫（Sigma–Aldrich）溶液进行结晶紫染色，随后在室温下孵育15分钟。移除多余的染料，并用蒸馏水洗涤样品。为了溶解结合的结晶紫，加入100 μl 33%乙酸（Sigma-Aldrich），并使用酶标仪（Synergy H1MF plate reader (BioTek Instruments, Inc.)）在570 nm处测量吸光度。细胞活力相对于未处理的对照孔计算为百分比，使用公式：细胞活力（%）= (处理孔的OD₅₇₀ / 对照孔的OD₅₇₀) × 100。

Measurement of PGD2 concentrations in samples

使用PGD₂-MOX酶免疫测定（EIA）试剂盒（Cayman Chemical）按照制造商的指南定量细胞培养上清液中PGD₂的水平。实验步骤如下：KU812细胞接种并用终浓度为3.7、37和100 μM的EMy-5处理。EMy-5在DMSO（Sigma-Aldrich）中重构，所有处理（包括对照组）中的DMSO浓度保持在0.5%。对照组和未处理组均接受0.5% DMSO而不含药物。细胞在标准培养条件（37°C，5% CO₂）下孵育24小时。之后，用1 μM A23187（Sigma-Aldrich）刺激细胞30分钟。刺激后，通过以800 rpm离心3分钟收集细胞培养上清液，并储存在-80°C直至进一步分析。上清液中PGD₂的浓度使用PGD₂-MOX EIA Kit（Cayman Chemical）测量。简言之，将200 μl样品或900 μl PGD₂标准品与等体积的甲基肟化（MOX）试剂（1:1, v/v）混合，并在60°C加热30分钟以稳定PGD₂-MOX衍生物。将制备好的样品与示踪剂和抗血清一起加入到IgG包被的微孔板中，并在4°C孵育过夜。第二天，清空孔，用洗涤缓冲液洗涤五次，并与200 μl Ellman's试剂（Sigma-Aldrich）在室温下避光孵育2小时。使用ELISA读数器（Synergy H1MF plate reader (BioTek Instruments, Inc.)）测量414 nm处的光密度（OD₄₁₄）以量化PGD₂浓度。

Molecular dynamics simulations

使用MD模拟研究了筛选出的抑制剂（EMw、EMx、EMy-1和EMy-5）从配体-药效团（Phar-A2HR2）映射中获得的结构构象。蛋白质-配体复合物的构建如下进行。最初，配体的构象是从配体-药效团映射的结果中获得的。随后，将拟合到药效团的配体重新定位在蛋白质结构中，该结构作为生成药效团模型的基础。在进行MD模拟之前，蛋白质-配体的复合物结构经过Discovery Studio 2021中的“Prepare proteins”方法处理，以消除这些结构中的任何错误。H-PGDS–抑制剂复合物的制备涉及使用Discovery Studio 2021中的“Prepare Proteins”协议来解决结构不一致性。每个复合物在CHARMM力场下溶剂化在一个正交模拟盒中，生理离子强度为0.15 M NaCl以确保系统中性。溶剂化细节包括添加水分子、钠离子和氯离子：H-PGDS对照组为5,952个水分子、20个钠离子和16个氯离子；抑制剂结合复合物应用了类似的配置，根据系统大小有微小变化。能量最小化分两个阶段进行：第一阶段包括使用最陡下降法的5,000步，第二阶段使用共轭梯度法的5,000步，确保优化的初始几何结构。随后是超过20 ps的加热阶段，逐渐将温度升高至300 K，以及使用Discovery Studio 2021中的Standard Dynamic Cascade协议进行500 ps的平衡阶段。随后的生产MD模拟在300 K的NVT系综下持续100 ns，轨迹快照以500 ps间隔记录。使用粒子网格Ewald（PME）方法计算静电相互作用，而SHAKE算法用于约束含氢键，允许2 fs的时间步长。广义Born隐式溶剂模型进一步提高了计算效率，同时保持了准确性。模拟后分析集中于关键参数，如均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）和回转半径（Rg），利用Discovery Studio 2021中的“Analyze Trajectory”工具。这些指标提供了对H-PGDS-抑制剂复合物与初始结构相比的动态行为和结构完整性的全面理解。RMSD分析量化了蛋白质-配体系统的整体构象稳定性，而RMSF提供了残基特异性的灵活性洞察。Rg值用于评估结构紧凑性，反映了抑制剂在模拟轨迹中对蛋白质稳定性和动态行为的影响。

Binding free energy calculation

结合自由能（ΔG）是配体与其靶蛋白之间相互作用强度的基本热力学指标。在本研究中，ΔG值使用分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MM/PBSA）方法估算，这是一种计算高效且广泛验证的方法，用于量化配体在蛋白质活性位点的绝对结合亲和力。该方法能够评估配体诱导的蛋白质-配体复合物的稳定或不稳定，从而深入了解其潜在的药效学功效。所有结合自由能计算均使用Discovery Studio 2021中实施的“Binding Free Energy – Single Trajectory”协议进行。对于每个蛋白质-配体复合物，ΔG值在模拟