纵隔反应性淋巴结病与结核性淋巴结炎淋巴结穿刺液淋巴细胞谱分析及其鉴别诊断价值

　　本文通过流式细胞术分析纵隔淋巴结穿刺液（LNPF）中的淋巴细胞谱（LP），发现反应性淋巴结病（RL）与结核性淋巴结炎（TBLA）在CD4? T细胞、CD8? T细胞、NK细胞等比例上存在显著差异。CD4/CD8比值对TBLA诊断效能最高（AUC=0.811），而CD4?+CD8?+NK细胞三联参数组合可进一步提升诊断准确性（准确率82.6%），为EBUS-TBNA术中快速鉴别良恶性淋巴结病变提供了新思路。

　　

Abstract

背景：纵隔淋巴结中淋巴细胞谱（LP）分析在鉴别反应性淋巴结病（RL）与结核性淋巴结炎（TBLA）中的作用尚未被充分研究。方法：研究纳入接受超声支气管镜引导下经支气管针吸活检（EBUS-TBNA）的胸内淋巴结肿大患者，通过流式细胞术比较TBLA与RL患者淋巴结穿刺液（LNPF）的LP特征，采用受试者工作特征（ROC）曲线确定最佳诊断界值，并计算敏感性、特异性和准确性。结果：共纳入41例TBLA和45例RL病例。与TBLA组相比，RL组LNPF中CD4? T细胞和B细胞比例升高，CD8? T细胞、自然杀伤（NK）细胞和自然杀伤T（NKT）细胞比例降低。单参数中CD4/CD8比值对TBLA的诊断效能最高（敏感性88.89%，特异性70.73%，准确性80.23%）。三参数组合中，CD4? T细胞、CD8? T细胞和NK细胞比例组合达到最佳诊断性能（敏感性80.5%，特异性86.7%，准确性82.6%）。

Introduction

胸内淋巴结肿大（IL）可由恶性或良性病因引起。良性病因包括肉芽肿性疾病（如结核病和结节病）和其他炎症性疾病，这些疾病需要不同的治疗策略，给病理学家和临床医生带来了巨大挑战。在肉芽肿性疾病中，纵隔结核性淋巴结炎（TBLA）由于临床表现非特异性以及获取足够淋巴结样本进行微生物学和病理学分析的困难而存在诊断难题。TBLA通常菌量较少，进一步增加了微生物学诊断的复杂性。淋巴结肿大也可能作为对潜在合并症的反应性反应而发生，称为反应性淋巴结病（RL）。RL与多种慢性疾病相关，包括肺气肿、慢性支气管炎、间质性肺病、支气管扩张、肺动脉高压、心力衰竭和结缔组织疾病。EBUS-TBNA是目前评估未确诊纵隔淋巴结病、诊断结节病和TBLA以及肺癌分期的首选微创技术。通过EBUS-TBNA获得的标本支持多模式分析，包括细胞学、流式细胞术、免疫组织化学、分子检测和微生物学检测（如GeneXpert MTB/RIF）。迄今为止，关于纵隔RL患者LNPF中LP特征的报道仍然缺乏，LP分析在区分RL与TBLA中的价值尚未得到全面研究。

Materials and Methods

这项前瞻性诊断准确性研究连续纳入了2020年5月至2024年4月期间在我院通过胸部计算机断层扫描（CT）检测到纵隔/肺门淋巴结肿大和肺部病变的396例患者。经过严格筛选标准，最终纳入41例结核性淋巴结炎（TBLA）患者和45例反应性淋巴结病（RL）患者。所有RL患者需要至少6个月的随访。RL的诊断仅在满足以下条件时确认：病理学取样（包括淋巴结抽吸、活检或细胞学）未发现其他诊断；临床随访≥6个月未发现任何新的诊断结果；主治医生根据临床、放射学和实验室评估排除了其他病因。排除标准包括：妊娠；入组前2周内患有急性传染病或使用免疫抑制剂/免疫刺激剂；严重合并症或器官系统功能障碍；临床资料不完整；失访；确诊艾滋病。收集并分析人口统计学和临床数据。本研究遵循1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修正案中概述的伦理原则，并获得我院伦理委员会批准（批准号：ke-616）。获得了所有患者或其法定监护人的书面知情同意。

EBUS-TBNA操作由经验丰富的操作者使用专用的EBUS设备（Olympus Medical Systems, Japan）和21G细针进行。操作在支气管镜检查室进行，使用异丙酚和芬太尼进行静脉麻醉。至少进行六次针吸：从一个淋巴结吸四次，从另一个淋巴结吸两次，或从单个可及淋巴结吸六次。抽吸样本排入含有20 mL生理盐水的无菌收集瓶中，并用生理盐水冲洗针头以回收残留细胞。固体组织碎片用无菌针头取出，固定在10%缓冲福尔马林中，用于常规组织病理学和抗酸染色。剩余的20 mL液体（淋巴结穿刺液，LNPF）分装：5 mL用于流式细胞术，5 mL用于细胞学，5 mL用于通过GeneXpert MTB/RIF平台（GeneXpert? DX System R2, GX-XVI, Cepheid, CA, USA）检测结核分枝杆菌（Mtb）DNA和利福平耐药基因。

根据支气管镜医师的判断进行经支气管肺活检（TBLB）和支气管内活检（EBB）。EBB适用于支气管内异常或临床怀疑结节病；TBLB适用于CT上的肺实质病变。标本进行组织病理学检查和抗酸染色。

LNPF通过金属网过滤并离心（300g, 1296 rpm）以沉淀细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，再次离心，并重悬用于流式细胞术分析。使用Beckman Coulter DXFlex流式细胞仪（Beckman Coulter Commercial Enterprise Co, CA, USA）和针对CD3、CD4、CD8、CD16、CD19和CD56的单克隆抗体（同一制造商）进行分析。为最小化可变LNPF稀释的影响，淋巴细胞亚群（如CD4? T细胞）报告为总淋巴细胞的百分比。

使用5个结核菌素单位的纯化蛋白衍生物（PPD）进行结核菌素皮肤试验（TST）。在给药后48和72小时测量硬结直径，阳性定义为硬结≥10 mm。

使用GeneXpert MTB/RIF平台上的标准化方案检测LNPF中的Mtb DNA和利福平耐药基因，主要针对疑似非肿瘤性疾病（如结节病、结核病、RL）的患者。

对来自TBNA、TBLB、EBB和浅表淋巴结的标本进行常规组织病理学分析。首先进行苏木精和伊红（H&E）染色，然后根据需要进行免疫组织化学分析。对TBNA、TBLB和EBB标本进行抗酸染色。在观察到肉芽肿性炎症的情况下，还进行过碘酸希夫（PAS）和六胺银（GMS）染色以排除真菌感染。

分类变量以计数和百分比（%）表示。连续变量报告为平均值±标准差（SD）或中位数与四分位距（IQR）。使用Shapiro-Wilk检验评估正态性。组间差异（TBLA vs RL）使用双样本t检验（正态分布变量）和Mann-Whitney U检验（非正态分布变量）进行评估。进行受试者工作特征（ROC）曲线分析以确定用于TBLA筛查的显著参数的最佳截断值。计算敏感性、特异性、准确性（π）和ROC曲线下面积（AUC）。样本量基于先验效能分析前瞻性确定。为以80%的统计效能和0.05的双侧显著性水平检测TBLA和RL组之间CD4/CD8比率的差异，每组至少需要40名患者。所有统计分析均使用SPSS软件（版本22.0; IBM Corp., Armonk, NY, USA）进行。双尾P值<0.05被认为具有统计学意义。

Results

共有396例连续患有纵隔/肺门淋巴结肿大和肺部病变（通过胸部CT检测）的患者接受了EBUS-TBNA。排除恶性肿瘤和其他非反应性/非结核性病因后，最终纳入41例结核性淋巴结炎（TBLA）患者和45例反应性淋巴结病（RL）患者。

45例RL病例与多种慢性疾病相关：间质性肺病（ILD; 33例，包括11例结缔组织病相关ILD，9例隐源性机化性肺炎，4例抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎，4例特发性间质性肺炎，2例过敏性肺炎，2例嗜酸性肉芽肿性多血管炎，1例IgG4相关疾病），慢性支气管炎（5例），支气管扩张（4例）和慢性阻塞性肺疾病（3例）。

TBLA和RL组的人口统计学和临床特征总结显示，两组在年龄、性别、吸烟状况和BMI方面具有可比性。然而，与RL组相比，TBLA组的炎症标志物水平，包括红细胞沉降率（ESR）和C反应蛋白（CRP），显著更高（两者P < 0.001）。

41例TBLA患者的详细诊断情况如下：检测到肉芽肿22例（53.7%），其中14例（34.1%）为坏死性肉芽肿。抗酸染色阳性12例（29.3%），GeneXpert MTB/RIF检测阳性32例（78.0%）。在32例GeneXpert MTB/RIF阳性的TBLA患者中，未检测到利福平耐药病例。半定量结果显示大多数病例为菌量稀少状态，DNA载量分类为极低15例（46.9%），低11例（34.4%），中6例（18.8%）。TST阳性30例（73.2%）。

比较了TBLA和反应性淋巴结病（RL）患者LNPF中的LP参数。与TBLA患者相比，RL患者表现出B细胞（BC%）、CD4? T细胞（CD4%）和CD4/CD8比值比例增加，CD8? T细胞（CD8%）、自然杀伤（NK）细胞（NK%）和自然杀伤T（NKT）细胞（NKT%）比例降低，总T细胞比例（TC%）无显著差异。值得注意的是，RL患者的CD4/CD8比值显著高于TBLA患者。

具有统计学意义的LP参数的诊断性能（敏感性、特异性、准确性和ROC曲线下面积[AUC]）显示，在单参数中，CD4/CD8比值对TBLA的诊断效用最高，敏感性为88.89%，特异性为70.73%，准确性为80.23%，AUC为0.811（P<0.001）。其次是CD4%（AUC=0.796）和NK%（AUC=0.781）。

为增强诊断精确度，分析了三个LP参数的组合。如果≥2个参数达到其各自的TBLA截断值，则将患者分类为TBLA。在测试的组合中，CD4% + CD8% + NK%组合实现了最高的准确性（82.56%），敏感性为80.5%，特异性为86.7%，AUC为0.843（95% CI: 0.755–0.932）。

Discussion

我们的结果表明，与结核性淋巴结炎（TBLA）患者相比，反应性淋巴结病（RL）患者在淋巴结穿刺液（LNPF）中表现出B细胞（BC%）、CD4? T细胞（CD4%）和CD4/CD8比值比例增加，以及CD8? T细胞（CD8%）、自然杀伤（NK）细胞（NK%）和自然杀伤T（NKT）细胞（NKT%）比例降低。总T细胞比例（TC%）未观察到显著差异。值得注意的是，RL患者的CD4/CD8比值显著高于TBLA患者。这些发现凸显了LNPF中淋巴细胞谱（LP）分析作为区分RL与TBLA的补充工具的潜力，单参数如CD4/CD8比值（准确性：80.23%）和NK%（准确性：77.91%）显示出强大的诊断性能。此外，结合CD4%、CD8%和NK%增强了诊断精确度（准确性：82.56%），强调了多参数分析的价值。

自2020年以来，全球结核病（TB）发病率出现反弹，2023年报告1080万例（95%不确定区间[UI]：1010–1170万），在因COVID-19中断三年后，结核病重新成为全球领先的传染病死因。在肺外结核中，TBLA由于非特异的临床特征和传统方法的局限性而仍然存在诊断挑战。当前的诊断金标准依赖于通过抗酸染色、分子检测或培养在痰液、支气管肺泡灌洗液（BALF）或组织中检测结核分枝杆菌（Mtb）。然而，这些方法受到低敏感性（例如，痰涂片镜检：汇总敏感性32–94%；TBLA中的Mtb培养：~50%敏感性）和长周转时间的限制。Xpert MTB/RIF assay是一种WHO推荐的针对rpoB基因的快速PCR检测，能够同时检测Mtb和利福平耐药性，但在肺外结核中的表现不一。例如，在纵隔淋巴结病中，LNPF中的Xpert MTB/RIF对TB的敏感性为49.1%，特异性为97.9%，在结节病中偶尔出现假阳性。这些局限性强调了辅助诊断工具的必要性，特别是在组织病理学缺乏肉芽肿特征时。

EBUS-TBNA已成为取样纵隔淋巴结的关键方式，可产生用于多模式分析的组织和LNPF。虽然先前的研究侧重于LNPF用于细菌学检测，但我们的研究将其效用扩展到通过流式细胞术进行LP分析。这种方法解决了一个关键空白：RL诊断传统上依赖于组织病理学以及排除恶性肿瘤或TB，此前尚无关于纵隔RL中LP的报道。值得注意的是，我们的发现与先前关于纵隔淋巴结中CD4/CD8比率的研究一致并扩展了其范围。例如，Peng等人使用免疫组织化学报告结节病中的CD4/CD8比率高于TB（7.3±1.8 vs 3.6±1.1, P<0.001），与我们之前的观察一致。通过使用流式细胞术分析LNPF，我们提供了对淋巴细胞亚群的更客观、定量的评估，避免了组织切片取样变异性的潜在偏差。

观察到的LP差异可能反映了TBLA和RL中不同的免疫反应。在TBLA中，NK细胞——先天免疫的关键效应器——通过表面受体（如NKG2D, DNAM-1）直接杀死Mtb和Mtb感染的细胞，在控制Mtb感染中发挥关键作用。TBLA中NK%升高可能因此反映了抗分枝杆菌免疫激活的增强。例如，先前的研究表明，NK细胞激活受体在活动性TB中下调，可能是由于与Mtb感染细胞长期接触的结果，然而它们的总体比例在局部淋巴结环境中可能增加。相反，RL由慢性刺激物（如ILD, COPD）驱动的反应性淋巴细胞增殖为特征，其特点是Th2极化或调节性免疫反应，这可能抑制NK和CD8? T细胞激活。RL中较高的CD4/CD8比率与这种Th2偏向一致，因为CD4? T细胞在非感染性、反应性淋巴组织增生中占主导地位。

LNPF中的LP分析具有几个优点：它可以整合到常规EBUS-TBNA工作流程中，无需额外的针吸次数，因为LNPF已经用于细胞学和微生物学收集；流式细胞术在三级中心广泛可用，使该方法可扩展；定量LP参数（如CD4/CD8比率）提供客观指标以补充主观的组织病理学评估。重要的是将LP分析定位为辅助诊断工具，而不是替代传统方法。其最大效用可能在于诊断具有挑战性的情况，例如患有非坏死性肉芽肿、菌量稀少疾病且微生物学检测阴性，或免疫应答不典型的免疫功能低下个体。它补充了，但不能替代，细菌学确认和药物敏感性测试。在资源有限的环境中仍然存在挑战，那里EBUS-TBNA和流式细胞术的可及性较低。未来的研究应探索简化的LP组合或床旁检测以增强适用性。

Limitations and Future Directions

本研究有几个局限性。首先，样本量（41 TBLA vs 45 RL）相对较小，可能限制了统计效能和普遍性，尽管它满足了我们先验效能计算的要求。虽然我们纳入了来自多种慢性疾病（如ILD, COPD）的RL病例，但病毒/细菌感染性病因的代表性不足，这可能影响LP模式的普遍性。其次，相对较小的样本量阻碍了多变量分析，限制了我们识别最佳参数组合的能力。第三，单中心招募可能引入机构偏倚，尽管使用了标准化的EBUS-TBNA和流式细胞术方案。第四，我们没有具体分析该测试可能最有用的亚组，例如免疫功能低下患者或组织病理学不确定的病例，这代表了未来研究的一个重要领域。为解决这些问题，未来的研究应：招募更大规模、多中心队列，包含更广泛病因（如病毒感染、细菌性淋巴结炎）的RL病例；进行正式的效能计算以证明样本量合理性；使用多变量模型验证LP发现以识别最具预测性的参数；探索LP在动态监测（如对抗TB治疗的反应）中的效用。

Conclusion

EBUS-TBNA能够同时收集组织和LNPF，支持包括通过流式细胞术进行LP在内的多模式分析。TBLA和RL之间LP参数（如CD4/CD8比率、NK%）的显著差异提高了鉴别诊断的准确性，尤其是在组合使用时。LNPF中的LP分析代表了一种新颖、实用的工具，可补充TBLA诊断检查中的组织病理学和微生物学，有可能减少误诊并指导及时治疗。

Abbreviations

BALF, bronchoalveolar lavage fluid; CT, computed tomography; EBB, endobronchial biopsy; EBUS-TBNA, endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration; LNPF, lymph node puncture fluid; LP, lymphocyte profile; Mtb, mycobacterium tuberculosis; RL, reactive lymphadenopathy; ROC, receiver operating characteristic; TB, tuberculosis; TBLA, tuberculous lymphadenitis; TBLB, transbronchial lung biopsy; TST, tuberculin skin test.

Ethics Approval and Consent to Participate

这项涉及人类参与者的前瞻性研究获得了首都医科大学附属北京朝阳医院伦理委员会的批准（编号：KE - 616），并符合1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修正案或可比伦理标准。获得了患者的书面知情同意。

Consent for Publication

获得了患者的书面知情同意。

Author Contributions

所有作者对报告的工作做出了重大贡献，无论是在构思、研究设计、执行、数据获取、分析和解释方面，还是在所有