IL2RG基因半合子变异通过损害STAT5磷酸化及转录活性导致X连锁重症联合免疫缺陷病

　　本研究深入探讨了X连锁重症联合免疫缺陷病（X-SCID）的分子机制，通过功能实验证实IL2RG基因变异（包括p.R190P、p.L172P等）会破坏IL-2介导的STAT5磷酸化（phosphorylation）和转录活性，导致免疫信号传导异常。该研究为精准诊断、遗传咨询及胚胎植入前遗传学检测（PGT）提供了关键理论依据。

　　

Abstract

X连锁重症联合免疫缺陷病（X-SCID）是一种由IL2RG基因致病性变异引起的遗传性免疫疾病，其特征为反复感染。识别这些变异并阐明其致病机制对于精准诊断、治疗、产前诊断及胚胎植入前遗传学检测（PGT）至关重要。本研究旨在从四个疑似免疫缺陷家系中鉴定候选变异，评估其致病性，阐明致病机制，并为精准干预提供依据。

Patients and Methods

四个疑似免疫缺陷家系入选自中信湘雅生殖与遗传专科医院。采用全外显子组测序（WES）鉴定遗传病因，并通过功能实验评估已识别IL2RG变异的致病性及其机制。

Results

WES鉴定出四个IL2RG变异：三个半合子变异（c.569G>C:p.R190P、c.515T>C:p.L172P、c.217A>C:p.T73P）和一个杂合变异（c.1091C>T:p.T364I），其中三个为新型变异。根据ACMG/AMP指南，最初三个变异（p.R190P、p.T73P和p.T364I）被归类为意义不明确变异（VUS），一个（p.L172P）为可能致病（LP）。功能分析显示，所有变异均导致STAT5磷酸化和转录活性降低，支持将三个变异（p.R190P、p.L172P和p.T73P）重新分类为可能致病（LP），一个变异（p.T364I）为VUS（贝叶斯评分为5）。此外，IP-MS分析显示突变型IL2RG导致细胞表面表达减少和核定位异常。因此，这些IL2RG变异通过损害IL-2诱导的STAT5磷酸化和转录活性，导致X-SCID。

Conclusion

本研究强调了功能分析在明确变异致病性中的关键作用，为IL2RG变异的致病性评估提供了清晰范例。整合基因组和功能数据可增强诊断精确性，并为X-SCID的精准治疗、遗传咨询、产前诊断和PGT提供信息。

Introduction

重症联合免疫缺陷病（SCID）是一种遗传性免疫疾病，以细胞和体液免疫严重缺陷为特征。X-SCID（OMIM300400）是最常见的SCID类型。患者婴幼儿期极易发生严重反复感染，免疫学上缺乏或显著减少T细胞和自然杀伤（NK）细胞，且B细胞无功能（T^?B⁺NK^?），若不治疗会导致严重发病或死亡。

X-SCID由IL2RG致病性变异引起，损害γc链介导的信号传导。IL2RG基因位于Xq13.1，编码γc链（一种跨膜蛋白）。当其与γc家族细胞因子结合后，胞内区启动信号级联，激活Janus激酶（Jak1和Jak3），导致STAT（信号转导和转录激活因子）蛋白酪氨酸磷酸化，尤其是STAT5。该信号通路对免疫细胞（包括T、B和NK细胞）的发育、增殖、活化和分化至关重要。IL2RG变异损害γc链介导的细胞因子信号，导致X-SCID。尽管其机制明确，但临床异质性仍存在，因此对VUS需进行功能分析以确定是否影响IL2RG功能并阐明机制。

本研究在四个疑似X-SCID家系中鉴定出三个VUS和一个LP变异。全面体外功能分析表明，所有四个IL2RG变异均损害IL2RG介导的STAT5磷酸化和转录活性。因此，三个变异（p.R190P、p.L172P和p.T73P）被重新分类为LP，一个（p.T364I）为VUS（贝叶斯评分5）。本研究为诊断治疗提供了理论基础，并为受累家系的产前诊断和PGT提供了新见解。

Materials and Methods

Patients

四个家系来自中信湘雅生殖与遗传专科医院。前三家系患者根据以下标准初步诊断为X-SCID：1）CD3⁺ T细胞<300/μL且对植物血凝素（PHA）反应<10%正常下限；2）年龄相关CD3⁺ T细胞减少（>4岁<1000/μL）且T细胞功能<30%正常下限；或3）男性携带IL2RG半合子变异。家系IV中女性的表妹有男性孩子疑似免疫缺陷。本研究经医院和中南大学伦理委员会批准（LL-SC-2019-033），并获得所有参与者或监护人的书面知情同意。

Whole-Exome Sequencing (WES)

从患者外周血提取基因组DNA，使用WES进行遗传病因鉴定。候选变异通过过滤策略识别，并根据ACMG/AMP指南基于人群数据、计算数据、功能数据和分离数据分类致病性。

Plasmid Constructs

将人IL2RG（NM_000206.3）全长编码区扩增并连接至pCMV载体（5'端带3×Flag标签），构建pCMV-3×Flag-WT-IL2RG。使用突变试剂盒将变异引入该载体，并通过Sanger测序验证序列。同时构建pCMV-Myc-JAK3质粒。

Cell Culture, Transfection, and Surface Staining

培养HEK293细胞，使用转染试剂瞬时转染野生型或突变型质粒。转染48小时后，使用Flag抗体和荧光二抗通过流式细胞术评估IL2RG（CD132）表面表达。

Western Blotting and Co-Immunoprecipitation Assay

转染HEK293细胞后提取蛋白质，进行Western blotting验证表达。为研究IL2RG与JAK3相互作用，先用AlphaFold预测，然后共转染pCMV-3×Flag-IL2RG（野生型或突变型）和pCMV-Myc-JAK3质粒，细胞裂解后使用抗Flag或抗Myc珠子进行Co-IP，并进行Western blot分析。

STAT5 Phosphorylation and Luciferase Assays

评估STAT5磷酸化：共转染Flag-IL2RG（野生型或突变型）和Myc-JAK3载体，用重组人IL-2（1000 U/mL）刺激30分钟，裂解细胞后进行免疫印迹分析。膜与抗Flag、抗Myc、Stat5、磷酸化Stat5（Tyr694）和GAPDH抗体孵育。

对于STAT5报告基因检测，将HEK293细胞铺于24孔板，共转染IL2RG质粒、Myc-JAK3载体和pGL4.52报告质粒。36小时后加入IL-2培养40分钟，裂解细胞并使用荧光素酶检测系统测量活性。

Immunoprecipitation-Mass Spectrometry

转染HEK293细胞并培养48小时，裂解细胞后进行Co-IP。MS分析中，珠子结合靶蛋白后用Triethylammonium bicarbonate缓冲液洗涤，并用胰蛋白酶消化。肽段使用Orbitrap Eclipse质谱仪分析，Proteome Discoverer软件处理原始文件，搜索UniProt人类数据库。缺失值使用DEP插补，差异表达蛋白通过limma包分析（p≤0.05且log2FoldChange>1.3）。

Statistical Analysis

使用Student t检验和单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析。

Results

Case Presentation

家系I患者（II-1）为4月龄男婴，表现为不明原因高热、双下肢肿胀，进展为全身性水肿、皮肤发红、寒战和血便。病原检测显示腺病毒和肺炎链球菌阳性。炎症标志物（CRP、SAA和IL-6）显著升高，血小板和淋巴细胞计数持续低下。淋巴细胞亚群分析显示CD3⁺ T细胞（3.82%）、CD3⁺CD4⁺ T细胞（2.32%）、CD3^?CD16⁺CD56⁺ NK细胞（6.14%）和CD3⁺CD8⁺ T细胞（0.36%）减少，CD4⁺/CD8⁺比率（6.38）和CD3^?CD19⁺ B细胞（86.86%）增加。患者疑似原发性免疫缺陷，正接受造血干细胞移植。

家系II患者（II-1）接种五价和轮状病毒疫苗后出现流涕、发热寒战，住院时感染标志物升高、腹泻、皮疹和背部瘢痕斑。炎症标志物（CRP、SAA和IL-6）升高。淋巴细胞亚群显示CD3⁺ T细胞（46.38%）、CD3⁺CD4⁺ T细胞（8.33%）、NK细胞（2.33%）和CD4⁺/CD8⁺比率（0.24）降低，CD3⁺CD8⁺ T细胞（34.42%）和B细胞（51.16%）升高。患者后来出现肝大、高脂血症、低纤维蛋白原血症，以及血红蛋白和血小板进行性下降，最终在6月17天时死亡。

家系III中一名疑似免疫缺陷的男性患儿在约10月龄时死亡。

家系IV中女性的表妹有一男性孩子疑似免疫缺陷，在8月龄时死亡。

Genetic Analysis

WES和分离分析鉴定出三个家系患者中IL2RG基因的半合子变异：c.569G>C:p.R190P、c.515T>C:p.L172P、c.217A>C:p.T73P。患者母亲为相应变异携带者。家系IV中患者姑妈（III-1）携带杂合IL2RG变异c.1091C>T:p.T364I。三个变异（p.R190P、p.T73P和p.T364I）为新型。所有错义变异发生在进化保守位点。p.L172P和p.R190P位于IL2RG的纤维连接蛋白III（2）结构域，p.T73P和p.T364I分别位于纤维连接蛋白III（1）结构域和胞质尾区。生物信息学工具预测三个变异为致病性，一个（p.T364I）为良性。根据ACMG/AMP标准，三个变异（p.R190P、p.T73P和p.T364I）最初分类为VUS，一个（p.L172P）为LP。

IL2RG Variants Reduce IL-2-Induced Phosphorylation and Transcriptional Activity of STAT5

IL2RG受体介导的信号传导依赖于JAK3与IL2RG胞内结构域的结合。为评估变异对相互作用的影响，使用五个质粒构建体（野生型、p.R190P、p.L172P、p.T73P和p.T364I）进行体外功能实验。AlphaFold预测四种突变型IL2RG蛋白与JAK3相互作用。Co-IP分析显示JAK3与突变型IL2RG蛋白（p.R190P、p.L172P和p.T364I）的结合显著减少，T73P突变蛋白与JAK3的结合仅适度减少。使用DynaMut2工具预测突变型IL2RG的稳定性，表明p.L172P、p.T73P和p.T364I导致蛋白不稳定，其中p.L172P最不稳定。流式细胞术分析显示，三种突变型IL2RG蛋白（p.R190P、p.L172P和p.T73P）在HEK293细胞表面表达显著减少。为研究变异对IL-2R信号的影响，IL-2刺激（1000 U/mL）后分析STAT5磷酸化，所有四种突变型均显示STAT5磷酸化大幅降低。荧光素酶报告实验进一步证实表达突变型IL2RG的细胞中STAT5转录活性降低。

这些发现表明所有四种IL2RG变异均通过减少JAK3相互作用、蛋白稳定性、表面表达以及下游STAT5磷酸化和转录活性，显著损害IL2RG信号传导。根据ACMG/AMP标准，三个变异（p.R190P、p.L172P和p.T73P）被重新分类为LP，一个变异（p.T364I）为VUS（贝叶斯评分5）。

IL2RG Variant Disturbs Its Plasma Membrane Targeting

为研究IL2RG变异如何影响蛋白功能，使用IP-MS分析突变型IL2RG蛋白的定位。差异表达蛋白（绝对log2FoldChange>1.3）按功能定位分类。分析显示四种突变型IL2RG蛋白与核蛋白相互作用增加，与质膜蛋白相互作用减少。基因本体（GO）分析显示这些差异表达蛋白主要参与染色质重组、核糖体加工、组蛋白甲基化和rRNA代谢等生物过程。这些发现表明四种突变型IL2RG蛋白增强与核蛋白的相互作用，减少与质膜蛋白的相互作用。这种破坏可能通过扰乱质膜靶向和导致异常核定位影响IL-2受体共同链的功能。

Discussion

本研究在四个疑似X-SCID家系中鉴定出四个IL2RG变异。通过Western blotting、Co-IP、荧光素酶报告实验、流式细胞术和IP-MS等一系列体外功能实验，证明所有变异均显著损害IL2RG介导的信号传导，导致JAK3相互作用减少、表面表达降低以及下游STAT5磷酸化和转录活性减少，原因是破坏质膜靶向和异常核定位。这些发现强有力地证明已识别的IL2RG变异导致X-SCID的发生。

IL2RG编码γc链，是多种细胞因子受体的关键亚基。缺陷破坏下游JAK-STAT信号通路，损害体液和细胞免疫，最终导致X-SCID。尽管ClinVar和HGMD记录了超过400个IL2RG变异（包括来自中国的64名患者），但并非所有都通过体外功能研究验证为致病性。本研究鉴定出四个IL2RG变异，最初分类为VUS或LP，其中三个为新型。进一步功能分析确认这些变异为LP或VUS（贝叶斯评分5），证明它们损害γc链功能，是所研究家系中X-SCID的病因。

AlphaFold和Co-IP是研究蛋白质相互作用的关键工具。本研究中，AlphaFold和Co-IP结果显示T73P突变型IL2RG蛋白与JAK3有强相互作用，最初提示该变异可能为良性。但进一步研究发现该突变蛋白显著降低下游STAT5磷酸化和转录活性，并破坏质膜靶向，最终将T73P重新分类为LP。这些发现强调了使用多种方法评估变异致病性的重要性，而非仅依赖Co-IP。

STAT5蛋白在免疫调节中起关键作用。STAT5B主要在造血细胞中表达，通过JAK-STAT通路介导酪氨酸磷酸化，这对淋巴细胞发育和分化至关重要，其缺陷与典型X-SCID相关。非典型X-SCID患者中，低浓度IL-2显著降低T淋巴细胞STAT5磷酸化，但高浓度刺激下与健康对照组相似。本研究显示，即使在高IL-2刺激下，转染突变型IL2RG质粒的细胞STAT5磷酸化也显著降低，表明IL-2信号传导严重受损。荧光素酶报告实验显示STAT5转录活性显著降低。IP-MS揭示这些突变型IL2RG蛋白破坏质膜靶向。基于这些发现，得出结论：已识别变异导致STAT5磷酸化和转录活性降低，原因是破坏质膜靶向、异常核定位和严重破坏细胞因子信号传导。

产前诊断和PGT在预防X-SCID患儿出生中起关键作用。X-SCID是最常见的SCID类型，约占所有SCID病例的50%。若不进行HSCT或基因治疗，严重感染常导致一岁内死亡。X-SCID以X连锁方式遗传，意味着携带致病性IL2RG变异的女性每次妊娠有25%风险生育患病儿子。已有产前诊断和PGT后成功生育健康孩子的报道。本研究为四个X-SCID家系进行产前诊断和PGT提供了宝贵理论基础，并为其他携带IL2RG变异的家系提供了参考。

Conclusion

本研究通过WES成功鉴定出四个X-SCID家系中的IL2RG变异，其中三个为新型。功能分析显示这些变异导致STAT5磷酸化和转录活性降低——这是维持免疫功能的关键过程，原因是突变型IL2RG蛋白细胞表面表达减少和核错误定位。这些发现不仅强调了全面功能研究在将VUS重新分类为LP中的关键作用，而且加深了对X-SCID致病机制的理解。这项工作强调了整合遗传和功能分析以增强诊断和治疗精确性、改善遗传咨询、指导产前诊断和PGT的重要性，从而可能改善X-SCID患者及其家庭的临床结局。

Abbreviations

X-SCID, X连锁重症联合免疫缺陷病; WES, 全外显子组测序; ACMG, 美国医学遗传学与基因组学学会; AMP, 分子病理学协会; LP, 可能致病; VUS, 意义不明确变异; NK, 自然杀伤细胞; γc/CD132, 共同细胞因子受体γ链; STAT, 信号转导和转录激活因子; Co-IP, 共免疫沉淀; IP-MS, 免疫沉淀-质谱; CRP, C反应蛋白; SAA, 血清淀粉样蛋白A; HGMD, 人类基因突变数据库; PGT, 胚胎植入前遗传学检测。

Editorial Policy and Ethical Considerations

本研究经中信湘雅生殖与遗传专科医院伦理委员会批准（LL-SC-2019-033），并遵循赫尔辛基宣言。

Consent for Publication

作者获得了患者或患者法定监护人对基因检测和匿名发表结果的书面知情同意。

Disclosure

作者声明本工作无利益冲突。

Data Sharing Statement

测序数据可向通讯作者合理请求获取，其他数据在稿件或补充信息文件中提供。