医院内碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌双重谱系持续共存与传播的分子流行病学研究

　　本研究系统解析了广东某医院碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌（CRPA）的分子流行病学特征，通过全基因组测序发现ST1971和O11分别为优势序列型（ST）和血清型，首次鉴定出携带blaVIM-2的IncP-6质粒，并揭示ICU环境中两个主要进化枝（clade 1/clade 2）的平行传播动态，为医院感染防控提供了关键分子依据。

　　

引言

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为革兰阴性条件致病菌，广泛存在于土壤、水体及医院环境中，是医疗相关感染的重要病原体。碳青霉烯类抗生素因其广谱抗菌活性和对超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的稳定性，成为治疗多重耐药菌感染的关键药物。然而，该类药物的广泛使用导致碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌（CRPA）的出现和传播，对临床抗感染治疗构成严峻挑战。

材料与方法

研究收集了2022年1月至2023年7月期间广东某医院的137株CRPA临床分离株。采用VITEK 2 COMPACT系统联合Kirby-Bauer法进行药敏试验，检测包括阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、多黏菌素B等14种抗生素的敏感性。通过Illumina NovaSeq 6000平台进行全基因组测序，使用FastQC、Trimmomatic和SPAdes进行数据质控和基因组组装。采用PAst在线工具和PubMLST数据库进行血清分型和序列分型（MLST），利用Resfinder、VFDB和PlasmidFinder数据库鉴定耐药基因（ARGs）、毒力基因和质粒复制子类型。系统发育分析通过IQ-TREE2进行，使用GTR+I+G4进化模型构建最大似然树。

结果

临床特征分析显示，呼吸道标本（41.6%）和支气管肺泡灌洗液（30.7%）是主要标本来源，66%的患者年龄超过60岁，且男性占比70.8%。重症监护室（ICU）来源的菌株占比达72.3%，其中老年ICU（GICU）占18.2%。药敏试验显示所有菌株对碳青霉烯类药物耐药，但对多黏菌素B的耐药率仅为0.7%（1/137）。分子分型鉴定出54种序列型（STs），其中ST1971（6.6%）、ST244（5.8%）和ST357（5.1%）为优势型；11种血清型中以O11（29.9%）、O6（15.3%）和O1（10.9%）为主。

耐药基因分析发现aph（氨基糖苷类）、bla（β-内酰胺类）、crpP（环丙沙星耐药）和RND外排泵基因（tmexD2/C3/D3）为主要耐药机制。在17株菌中检测到4种质粒复制子类型（ColRNAI、IncP-6、IncQ-2和IncFII），其中IncP-6质粒携带bla_VIM-2、bla_OXA-10和qnrVC1等多重耐药基因。值得注意的是，IncP-6阳性菌株对9/12抗生素的耐药性升高2-32倍（P < 0.05）。

系统发育分析将菌株划分为两个主要进化枝（clade 1: 86株；clade 2: 46株），SNP分析显示枝内遗传距离中位数分别为157和185。时空传播分析发现2022年8月11-15日在GICU存在显著传播簇（相对风险RR=21.39-40.11），IncP-6阳性菌株（ly004等）的SNP差异仅为0-3个，表明克隆传播。

讨论

本研究揭示了CRPA在医院环境中的遗传多样性和传播动态。高风险克隆ST244、ST277和ST357与国内流行株ST1971的共存，以及O11、O6等高风险血清型的主导地位，凸显了其公共卫生威胁。IncP-6质粒携带bla_VIM-2的发现，首次证实了该类质粒在CRPA碳青霉烯耐药传播中的作用。ICU环境中bla_OXA-10和bla_VIM-2的 exclusivity分布，反映了抗菌药物选择压力对耐药基因传播的驱动作用。

两个进化枝的平行传播现象表明多重独立传播链的存在，而GICU作为传播枢纽的发现，强调了重点部门感染控制的重要性。研究局限性包括缺乏患者临床预后数据和移动轨迹信息，未来需整合多组学数据与流行病学调查以精准溯源。

结论

本研究通过基因组流行病学方法，揭示了CRPA在医院内的分子特征、耐药机制和传播规律，为制定精准感控策略提供了科学依据。持续监测高风险克隆和移动遗传元件的传播，对遏制CRPA的医院播散具有重要意义。