韩国三级医院呼吸道标本非结核分枝杆菌物种分布特征及新菌种发现（2017–2022）

　　本研究系统分析了2017–2022年韩国三级医院呼吸道标本中非结核分枝杆菌（NTM）的物种分布趋势，发现NTM在分枝杆菌分离株中占比显著上升至93.3%，其中鸟分枝杆菌复合群（MAC）占主导（61.9%），脓肿分枝杆菌（14.2%）次之。研究通过多基因测序鉴定出24种罕见菌种，并发现2个可能的新菌种，为优化NTM肺病的诊断策略和治疗方案提供了重要地域流行病学依据。

　　

引言

非结核分枝杆菌（NTM）肺病因其全球患病率上升和长期预后不良而日益成为重要的公共卫生问题。NTM的临床相关性和耐药模式因物种而异，且呼吸道标本中NTM的物种分布存在地理差异。因此，了解NTM物种的地理分布对于选择适当的治疗方案和改善患者预后至关重要。线探针 assays（LPAs）虽广泛用于临床微生物实验室，但其探针数量有限，且可能与无关物种发生交叉杂交，导致罕见NTM物种鉴定失败或错误识别。在韩国，先前关于呼吸道标本NTM物种分布的研究往往纳入的分离株数量有限，或依赖鉴别能力较低的物种鉴定方法，导致关于罕见NTM物种的数据不足。三星医疗中心是韩国首尔的一家拥有2000张床位的三级护理医院，为全国大量NTM患者提供服务。本研究分析了2017年至2022年间提交至三星医疗中心临床微生物学实验室的呼吸道标本中7397株NTM分离株的物种分布。在此期间，对通过LPA无法在物种或复合群水平上鉴定的分离株进行了16S rRNA、rpoB和hsp65基因的多基因测序，从而能够分析罕见NTM物种的比例。

材料与方法

数据收集

从实验室信息系统中提取了2017年1月至2022年12月期间提交至三星医疗中心临床微生物学实验室进行抗酸杆菌（AFB）培养的呼吸道标本的实验室数据。这些数据包括AFB培养和物种鉴定的结果。对于从AFB培养中分离出NTM的病例，检索患者的地址并将其分为五个区域：（i）首尔首都圈（SCA），包括首尔市、仁川市和京畿道；（ii）江原地区，包括江原道；（iii）忠清地区，包括忠清北道、忠清南道、大田市和世宗市；（iv）庆尚地区，包括庆尚北道、庆尚南道、釜山市、大邱市和蔚山市；以及（v）全罗地区，包括全罗北道、全罗南道、济州道和光州市。

AFB培养

呼吸道标本采用N-乙酰-L-半胱氨酸–NaOH方法进行处理，并接种到分枝杆菌生长指示管（BD，Sparks，MD，USA）和3%小川培养基（Shinyang，首尔，韩国）中，随后培养6周。所有阳性培养物均进行Ziehl-Neelsen染色以确认AFB的存在。对于确认为AFB阳性的培养物，采用煮沸法提取DNA，并使用GREENCARE MTB/NTM检测试剂盒（GC Medical Science，龙仁，韩国）进行实时PCR，以区分结核分枝杆菌复合群（MTBC）和NTM，按照制造商的说明进行。简而言之，将5 μL提取的DNA加入15 μL含有引物和探针的预混液中，总反应体积为20 μL。在Applied Biosystems 7500实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）上进行扩增，循环条件如下：95°C 15分钟，随后40个循环的95°C 15秒和60°C 30秒。该检测靶向IS6110区域用于MTBC检测（FAM通道）和16S rRNA基因作为泛分枝杆菌靶标用于NTM检测（VIC通道）。当MTBC靶标阳性（循环阈值[Ct]值≤40）且其Ct值低于泛分枝杆菌靶标的Ct值时，培养物被分类为MTBC阳性。如果MTBC靶标的Ct值高于泛分枝杆菌靶标，则培养物被分类为MTBC和NTM均阳性。当泛分枝杆菌靶标阳性（Ct值≤35）且MTBC靶标阴性时，培养物被视为NTM阳性。

物种鉴定

经实时PCR确认的NTM分离株，在主治医师的请求下，使用AdvanSure Mycobacteria GenoBlot Assay进行物种鉴定。该检测靶向内部转录间隔区，可同时鉴定22种分枝杆菌物种和复合群，包括MTBC、M. avium、M. intracellulare、M. abscessus、M. chelonae、M. fortuitum复合群、M. peregrinum、M. kansasii、M. gordonae、M. lentiflavum/M. genavense、M. terrae复合群、M. simiae、M. scrofulaceum、M. celatum、M. malmoense、M. gastri、M. flavescens、M. vaccae、M. xenopi、M. smegmatis、M. szulgai和M. marinum/M. ulcerans。先前的研究表明，该检测在鉴定常见NTM物种方面表现良好，并与广泛使用的GenoType Mycobacterium CM/AS检测具有相当的准确性。按照制造商的说明进行操作。简而言之，使用煮沸法提取DNA。每个PCR反应包含7.5 μL提取的DNA、12.5 μL 2×反应混合物和5 μL引物混合物，总体积为25 μL。在Applied Biosystems 7500实时PCR系统上进行扩增，循环条件如下：50°C 2分钟和95°C 10分钟，随后15个循环的94°C 30秒、65°C 1分钟和72°C 30秒；然后38个循环的94°C 30秒、55°C 1分钟和72°C 30秒；最后72°C 10分钟终延伸。随后对PCR产物进行杂交、洗涤和染色。使用AdvanSure GenoLine Scan（Invitros）检测和解释条带上的条带强度和模式。鉴定为M. abscessus的NTM分离株进一步使用ERM-plus实时PCR试剂盒（Invitros）进行分析，该试剂盒通过检测红霉素核糖体甲基转移酶（erm）基因区分M. abscessus subsp. abscessus和M. abscessus subsp. massiliense。

无法通过AdvanSure Mycobacteria GenoBlot Assay在物种或复合群水平上鉴定的NTM分离株，进一步通过16S rRNA、rpoB和hsp65基因的多基因测序进行分析。使用MagNA Pure 96系统（Roche Diagnostics，Basel，Switzerland）提取基因组DNA。使用以下引物组进行PCR扩增：对于16S rRNA基因，正向5′-GAGAATTCGTGCTTAACACATGCAAGTCG-3′，反向5′-ATGGATCCGTGAGATTTCACGAACAACGC-3′；对于rpoB基因，正向5′-GGCAAGGTCACCCCGAAGGG-3′，反向5′-AGCGGCTGCTGGGTGATCATC-3′；对于hsp65基因，正向5′-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3′，反向5′-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3′。PCR循环条件如下：90°C 10分钟；40个循环的94°C 25秒、60°C 30秒和72°C 45秒；随后72°C 10分钟终延伸步骤。使用与扩增相同的引物对PCR产物进行测序。将获得的序列与GenBank数据库中的序列进行比较，使用基本局部比对搜索工具（BLAST；https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），并根据临床和实验室标准协会指南MM18第二版中概述的标准进行解释。物种鉴定方法在整个研究期间保持一致。

全基因组测序分析

通过多基因测序在物种或复合群水平上仍未解决的NTM分离株，进一步使用全基因组测序（WGS）进行分析以确定其分类地位。按照Bouso等人的描述提取基因组DNA，并在HiSeq X Ten（Illumina，San Diego，CA，USA）和GridION（Oxford Nanopore Technology，Oxford，UK）平台上进行WGS。使用Canu v2.1.1组装纳米孔读数，并使用Illumina读数通过Pilon v1.24进行抛光，或者使用Unicycler v0.4.9对纳米孔和Illumina读数进行混合组装。使用Prokka v1.14.6对组装的基因组进行注释，并使用Proksee进行可视化。通过计算平均核苷酸同一性（ANI）和数字DNA-DNA杂交（dDDH）值来确定这些分离株的分类地位。使用EzBioCloud服务器上的OrthoANIu算法计算ANI值（https://www.ezbiocloud.net/），并使用类型（菌株）基因组服务器上的公式d4计算dDDH值（https://tygs.dsmz.de/）。

数据分析

在计算NTM物种分布时，从一个标本中分离出的多个物种被计为不同的分离株。对于重复分离出相同物种的患者，仅纳入首次分离株，排除重复分离株。使用趋势卡方检验评估呼吸道标本中所有分枝杆菌分离株中NTM比例的年度变化以及主要NTM物种比例的年度变化。P值<0.05被认为具有统计学意义。使用Excel（Microsoft，Redmond，WA，USA）和Epi Info 7（疾病控制与预防中心，Atlanta，GA，USA）进行统计分析。

结果

NTM分离株比例的年度趋势

在研究期间，共提交了来自38797名患者的147543份呼吸道标本进行AFB培养。最常见的标本类型是痰（89.0%），其次是支气管冲洗液或支气管肺泡灌洗液（10.0%）、气管内吸出物（0.9%）、肺吸出物（0.05%）和其他标本类型（0.07%）。这些标本中，67.0%来自门诊患者，33.0%来自住院患者。根据AFB培养结果，3370份（2.3%）对MTBC呈阳性，29365份（19.9%）对NTM呈阳性，35份（0.02%）对MTBC和NTM均呈阳性。因此，NTM占所有分枝杆菌分离株的89.6%（29400/32805）。尽管NTM分离株的数量没有增加，但所有分枝杆菌分离株中NTM的比例呈现总体上升趋势，从2017年的87.4%（5057/5784）上升至2022年的93.3%（5032/5393）。这一趋势具有统计学意义（P < 0.001）。

NTM物种分布

在29400株AFB培养生长的NTM分离株中，来自5369名患者的22425株（76.3%）应主治医师的要求进行了物种鉴定。将单个标本中的多个物种计为不同的分离株，并排除来自同一患者的重复分离株后，7397株NTM分离株被纳入物种分布分析。八种最常分离的NTM是M. avium复合群（61.9%，n = 4578）、M. abscessus（14.2%，n = 1048）、M. fortuitum复合群（8.4%，n = 618）、M. gordonae（5.3%，n = 390）、M. simiae复合群（3.4%，n = 250）、M. kansasii复合群（1.9%，n = 144）、M. terrae复合群（1.5%，n = 110）和M. chelonae（1.2%，n = 90），占所有NTM分离株的97.7%。这些主要物种在研究期间的比例趋势如图3所示。未观察到M. avium复合群、M. fortuitum复合群和M. terrae复合群比例的显著趋势（分别为P = 0.428、P = 0.561和P = 0.175）。相反，M. abscessus的比例呈现显著下降趋势（P < 0.001），而M. gordonae、M. simiae复合群、M. kansasii复合群和M. chelonae的比例呈现显著上升趋势（分别为P < 0.001、P = 0.008、P = 0.010和P = 0.002）。在M. avium复合群内，M. intracellulare是最常分离的物种（50.7%，n = 2323），其次是M. avium（49.2%，n = 2252）、M. timonense（0.04%，n = 2）和一株无法在物种水平鉴定的分离株（0.02%）。M. avium与M. intracellulare的相对比率为0.97，并在研究期间呈现显著下降趋势（P = 0.013），从2017年的1.09下降至2022年的0.88。在M. abscessus内，M. abscessus subsp. abscessus（62.3%，n = 653）的分离频率是M. abscessus subsp. massiliense（37.7%，n = 395）的1.65倍。M. abscessus subsp. abscessus与M. abscessus subsp. massiliense的相对比率在研究期间无显著趋势（P = 0.681）。

八个主要物种的地理分布如图4所示。M. avium复合群是所有五个区域中最常分离的物种，占所有NTM分离株的61.1%至68.4%。其次是M. abscessus，占9.2%至15.4%，以及M. fortuitum复合群，比例为6.8%至9.0%。M. avium与M. intracellulare的相对比率在北部区域（SCA：1.36；江原：0.68）高于南部区域（忠清：0.45；庆尚：0.43；全罗：0.56）。相反，M. abscessus subsp. abscessus与M. abscessus subsp. massiliense的相对比率在南部区域（忠清：2.30；庆尚：2.07；全罗：2.33）高于北部区域（SCA：1.47；江原：1.33）。

除八个主要物种外的NTM分离株占所有NTM分离株的2.3%（n = 169），其中161株被分类为24个物种和群组。其中，17个（70.8%）的比例低于0.1%。尽管进行了多基因测序，仍有八株分离株无法在物种或群组水平上鉴定，其通过序列分析确定的最接近物种列于表1。其中两株分离株（SMC-2和SMC-4）进行了WGS。基因组分析显示，菌株SMC-2的基因组由一个5,978,569 bp的环状染色体和一个49,197 bp的环状质粒组成，总大小为6,027,766 bp，DNA G+C含量为67.6%。基因组注释预测共有5694个基因，包括5639个蛋白质编码基因、50个tRNA基因、3个rRNA基因和2个tmRNA基因。菌株SMC-4的基因组包含一个5,584,205 bp的环状染色体、两个环状质粒（134,412 bp和25,902 bp）以及八个线性contig（范围从1,489 bp至70,493 bp），总基因组大小为5,936,685 bp，DNA G+C含量为66.6%。基因组注释预测5700个基因，包括5644个蛋白质编码基因、49个tRNA基因、6个rRNA基因和1个tmRNA基因。这两株分离株与密切相关的Mycobacterium类型菌株之间的ANI和dDDH值对于SMC-2范围分别为82.5%至89.5%和25.4%至38.6%，对于SMC-4范围分别为76.8%至83.9%和20.1%至27.1%，均低于物种划分阈值（ANI为95%–96%，dDDH为70%）。

讨论

通过分析来自一家服务全国大量NTM患者的大型三级护理医院的实验室数据，我们提供了2017年至2022年韩国NTM流行病学的估计。通过分析大量NTM分离株并利用具有高鉴别能力的多基因测序和WGS，我们获得了关于罕见NTM物种分布以及新Mycobacterium物种的宝贵数据。考虑到NTM物种间临床相关性和耐药模式的显著差异，本研究中呈现的物种分布数据有助于在韩国精确诊断和有效管理NTM肺病。

我们观察到2017年至2022年间呼吸道标本中所有分枝杆菌分离株中NTM的比例显著增加，这一趋势与韩国先前的报告一致。然而，NTM分离株的绝对数量并未增加，这可能是由于COVID-19大流行期间患者前往三级护理医院的机会减少所致。M. avium复合群是最常分离的NTM（61.9%），其次是M. abscessus（14.2%）和M. fortuitum复合群（8.4%），这与该国先前的研究一致。八种最常分离的NTM物种（M. avium复合群、M. abscessus、M. fortuitum复合群、M. gordonae、M. simiae复合群、M. kansasii复合群、M. terrae复合群和M. chelonae）占所有NTM分离株的97.7%，表明靶向这些主要物种的分子检测可以鉴定韩国呼吸道标本中绝大多数NTM分离株。除了这些主要物种外，我们还鉴定出24个额外物种和群组，其中大多数比例低于0.1%。一些物种，包括M. duvalii、M. elephantis、M. holsaticum、M. iranicum和M. shinjukuense，已被报道与人类疾病有关。然而，临床微生物学实验室广泛使用的商业LPA无法鉴定这些罕见但临床重要的物种。因此，医院和参考实验室需要能够可靠鉴定它们的诊断工具。

M. avium复合群是大多数国家最常分离的NTM；然而，该复合群内的物种分布在不同国家以及国家内的不同地区之间存在差异。在本研究中，M. avium与M. intracellulare的相对比率在北部区域（0.68–1.36）高于南部区域（0.43–0.56），这与先前的研究一致。与M. avium复合群内的物种分布相比，M. abscessus内的亚种分布研究较少。然而，了解这种分布很重要，因为M. abscessus亚种在大环内酯耐药性方面存在差异，因此对大环内酯为基础的治疗反应不同。在本研究中，M. abscessus subsp. abscessus与M. abscessus subsp. massiliense的相对比率在南部区域（2.07–2.33）高于北部区域（1.33–1.47）。然而，先前的研究报告了相反的趋势，南部区域的比率较低（1.62），北部区域的比率较高（2.44–5.19）。这些相互矛盾的发现凸显了需要进行大规模全国性研究以澄清M. abscessus亚种的地理分布。韩国北部和南部区域之间物种分布的差异可能归因于当地环境的差异，因为NTM通常从环境来源（如水和土壤）获得。需要进一步的研究来探索可能解释物种分布地理差异的物种特异性环境生态位。

与LPA相比，基因测序提供更高的鉴别能力，并被认为是NTM鉴定的参考标准。值得注意的是，补充16S rRNA基因测序与其他靶标（如rpoB和hsp65）可提供最高的鉴别能力，使得能够在物种（如M. abscessus）中进行亚种水平鉴定。然而，尽管使用了这种方法，仍有八株NTM分离株（0.11%）无法在物种或群组水平上鉴定。这些分离株由于与现有物种的序列相似性低，被认为可能代表新的Mycobacterium物种，对两株分离株的基因组分析证实了这一点。基因测序和WGS的可用性通过促进新物种的发现和现有物种的重新分类，推动了分枝杆菌分类学的进步。鉴于新物种的临床相关性通常不明确，持续监测其分离情况并收集受影响患者的临床数据至关重要。

本研究的一个主要局限性是它在单中心进行，可能不能完全反映韩国的全国NTM流行病学。特别是，来自SCA以外区域的NTM分离株数量相对较低，每个区域从152株到953株不等。这可能反映了SCA的人口集中度，限制了我们准确评估区域物种分布的能力。此外，我们中心提交进行AFB培养的呼吸道标本中NTM分离率（19.9%）显著高于在类似期间接收来自多家医院标本的参考实验室研究中观察到的比率（3.7%）。所有分枝杆菌分离株中NTM的比例在我们中心（89.6%）也显著高于先前研究（46.2%）。这些差异表明我们中心的患者人群可能与其他医院有显著不同，因此将我们的发现推广到韩国全国NTM流行病学是不合适的。

另一个局限性是我们的研究仅分析了呼吸道标本中NTM分离株的频率和物种分布，而未评估其临床相关性。特别是，由于罕见NTM物种的临床相关性通常不明确，需要进一步研究以澄清它们在疾病中的作用。此外，我们的分析包括了相对大量低毒力分离株，如M. gordonae和M. terrae复合群，它们不太可能是真正的病原体。NTM比例的年度增加也可能反映了NTM肺病相比结核病需要更长的治疗和随访时间。因此，这一趋势不应被解释为NTM肺病真实发病率的增加。此外，我们排除重复分离株的方法对仅检测到一次的分离株和重复检测到的分离株赋予同等权重，可能导致低估NTM肺病中主要病原体的频率。

此外，由于多基因测序仅对通过LPA无法在物种或复合群水平上鉴定的NTM分离株进行，因此无法全面评估物种和亚种分布。例如，M. intracellulare subsp. chimaera可能被LPA简单地报告为M. intracellulare，并且无法与其他亚区分开。类似地，尽管我们试图通过检测erm基因区分M. abscessus subsp. abscessus和M. abscessus subsp. massiliense，但罕见的亚种M. abscessus subsp. bolletii也携带该基因。因此，本研究中一些鉴定为M. abscessus subsp. abscessus的分离株实际上可能是M. abscessus subsp. bolletii。需要对所有NTM分离株使用多基因测序进行进一步研究，以准确确定物种和亚种分布。最后，我们的结果可能存在偏差，因为物种鉴定仅在主治医师请求时进行。

结论

总之，我们的研究揭示了NTM比例的增加，其中M. avium复合群和M. abscessus仍然占主导地位。我们还观察到M. avium复合群内物种分布和M. abscessus内亚种分布的区域差异。此外，我们鉴定了24种罕见物种和群组，以及两株可能代表新Mycobacterium物种的菌株。虽然我们未评估NTM肺病的流行病学，但我们的发现增强了对韩国呼吸道标本中NTM分离株不断变化的流行病学的理解。这可能有助于优化诊断策略和选择适当的治疗方案，最终为应对全球NTM发病率上升和制定有效治疗策略的努力做出贡献。