基于同源序列比对的二代测序技术优化CYP21A2变异检测及其在21-羟化酶缺乏症中的应用研究

　　本研究开发了一种创新的同源序列分析（HSA）算法，结合二代测序（NGS）技术，显著提升了CYP21A2基因变异检测的准确性与效率。该研究通过计算同源区域测序读段比例，成功识别单核苷酸变异（SNV）、插入/缺失（Indel）、拷贝数变异（CNV）及基因融合事件，阳性预测值（PPV）达96.26%。这一方法突破了传统诊断技术（如MLPA和LR-PCR）在高同源区域分析中的局限性，为先天性肾上腺皮质增生症（CAH）的精准基因诊断提供了高效、低成本的解决方案，并具备拓展至其他同源基因家族（如HBA1/HBA2、SMN1/SMN2）应用的潜力。

　　

引言

先天性肾上腺皮质增生症（CAH）是一种常染色体隐性遗传病，其中95%的病例由21-羟化酶缺乏症（21-OHD）引起，其致病基因为CYP21A2。该基因编码的细胞色素P450c21（CYP21）在糖皮质激素合成中催化17-羟孕酮（17-OHP）转化为11-脱氧皮质醇。酶活性缺失会导致17-OHP堆积和雄激素过量，临床表现为女性男性化、男性假性性早熟等。全球发病率约为1/10,000至1/2,000，中国浙江省报道为0.38/10,000。

CYP21A2位于RCCX模块中，其假基因CYP21A1P与之具有98%的同源性，但携带15个失活突变。这种高同源性导致常规测序分析中易出现错配和误判，尤其是拷贝数变异（CNV）和基因转换事件的检测。传统方法如MLPA和LR-PCR虽能部分解决这一问题，但通量低、成本高，且无法适应大规模筛查需求。二代测序（NGS）技术的引入虽提升了检测效率，但仍受限于同源区域的比对错误。

材料与方法

研究纳入2022年4月至2023年2月宁波大学妇女儿童医院的100例参与者，包括16例21-OHD患者和84例CYP21A2突变携带者。所有样本均经临床和遗传学确认，并获伦理委员会批准（2021-ky-036）。

基因组DNA通过QIAamp? DNA Blood Mini Kit提取，构建文库后使用Twist Human Core Exome Multiplex Hybridization Kit进行全外显子测序（WES），并在Illumina NovaSeq平台上测序。原始数据经bcl2fastq2转换后，使用BWA比对至hg19参考基因组，GATK4进行变异检测，ANNOVAR进行注释。CNV分析采用内部工具CNVexon，基于区域覆盖深度计算拷贝数变化。

核心创新点为同源序列比对（HSA）算法的开发。该算法通过计算基因与假基因的测序读段比例（G2P）及其自然对数（Misalignment Index, MI），识别同源区域的错配现象。基因特异性核苷酸（GSN）位点用于区分真基因与假基因序列。MI基线在正常条件下为0（G2P=1），但会因CNV或基因转换而调整（例如单拷贝缺失时MI=-0.69）。算法通过511例健康人群的数据校准了各外显子的MI阈值，特别针对exon 8-10的高转换频率进行了优化。

所有变异均遵循ACMG/AMP指南分类，并通过LR-PCR、Sanger测序或MLPA验证。LR-PCR使用EmeraldAmp? MAX HS PCR Master Mix，MLPA采用MRC Holland的P050-C1探针组合，数据通过Coffalyser.net分析。

结果

共检测到107个致病或可能致病变异（PLPV），包括93个SNV/Indel、6个CNV和8个CYP21A2-CYP21A1P融合突变。HSA算法的总体阳性预测值（PPV）为96.26%（103/107验证一致）。

小变异中以无义突变最常见（66.67%），其中exon 8的c.955C>T（p.Gln319*）占98.39%；错义突变（30.11%）主要集中在exon 7和8，如c.518T>A（p.Ile173Asn）和c.844G>T（p.Val282Leu）；内含子区域如c.293-13C>G和c.292+1G>A也被检出。HSA成功识别了51个假阳性和5个假阴性位点，并经实验验证。例如，c.955C>T在exon 8因假基因同源区误比导致假阳性，而c.518T>A和c.1069C>T则因误比至假基因而漏检。

CNV均为 exon 缺失，其中5例为全部10个exon缺失，1例为exon 1-6缺失。MI基线在CNV存在时发生偏移（如单拷贝缺失时MI=-0.69），MLPA结果与HSA预测完全一致。

8例融合突变涉及exon 1-3、2-3、6、4-7和4-8区域。例如，样本9、97、86中exon 1-3的MI异常提示基因转换，MLPA显示CYP21A1P拷贝数增加而CYP21A2降低；exon 6融合经LR-PCR验证发现4个GSN位点突变（c.[705T>C;710T>A;713T>A;719T>A]）；exon 4-8融合则通过LR-PCR检测到6个GSN位点杂合突变。这些结果证实了HSA在复杂重组事件中的检测能力。

讨论

基因重复进化导致的高同源区域（如CYP21A2/CYP21A1P）是NGS数据分析的难点，传统比对工具（如BLAST）难以避免误比。HSA算法通过读段深度比较和MI计算，有效区分了真变异与假基因干扰，提升了CAH的诊断准确性。

本研究验证了HSA在SNV、CNV和融合突变检测中的可靠性，尤其解决了常见突变（如c.955C>T）的假阳性问题。该方法较商业工具（如Illumina Dragen CYP21A2 caller）更具成本效益，且适用于外显子测序数据，利于临床推广。此外，HSA的策略可拓展至其他同源基因家族（如HBA1/HBA2、SMN1/SMN2），但需针对特定GSN位点和基线进行校准。

当前CAH诊断依赖17-OHP检测（GC-MS/LC-MS/MS），但存在假阳性高、无法识别非经典病例等问题。NGS结合HSA提供了基因分型的金标准，有助于明确基因型-表型关联、指导治疗和遗传咨询。例如，酶活性低于1%会导致盐浪费型危机，而1-2%活性则需警惕应激性肾上腺危象。

局限性

本研究仅针对阳性样本验证了HSA的准确性，未评估阴性预测值（NPV）或大规模人群性能。算法仍依赖人工阈值设定，未来需开发自动化工具。此外，HSA在其他同源基因的应用需进一步验证和校准。

结论

HSA算法通过同源区域读段深度分析，显著提升了CYP21A2变异的检测精度，克服了NGS在高同源区域的局限。该方法为CAH的精准诊断提供了高效、经济的解决方案，并具备潜力应用于其他复杂基因组区域的突变筛查，推动出生缺陷的三级预防。

缩写说明

CAH（先天性肾上腺皮质增生症）、21-OHD（21-羟化酶缺乏症）、NGS（二代测序）、HSA（同源序列比对）、SNV（单核苷酸变异）、CNV（拷贝数变异）、MLPA（多重连接依赖探针扩增）、LR-PCR（长片段PCR）、GSN（基因特异性核苷酸）、MI（错配指数）、G2P（基因与假基因比率）。