山奈素靶向HIF-1信号通路抑制骨关节炎进展的机制研究

　　本文系统探讨了天然黄酮类化合物山奈素（KA）通过调控缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路，抑制炎症因子（如MMP-2、MMP-13、COX-2、iNOS）表达，改善软骨降解和关节功能，为骨关节炎（OA）的疾病修饰治疗提供新策略。

　　

Introduction

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种以软骨退化、软骨下骨硬化和滑膜肥大为特征的退行性关节疾病，临床表现为疼痛、肿胀和活动受限。其全球患病率从2013年的2.5亿增至2020年的5.95亿，占全球人口的7.6%，预计到2050年膝OA、手OA和髋OA的患病率将分别增长75%、48%和76%。OA已成为全球第15大致残性疾病，年均医疗费用高达1.5万美元/患者，总潜在工资损失达650亿美元。

目前OA的早期治疗以姑息疗法为主，如非甾体抗炎药和关节内注射糖皮质激素，但缺乏能够延缓疾病进展的疾病修饰药物（DMOADs）。OA的发病机制涉及多种信号通路，包括Wnt、NF-κB、AMPK、mTOR、HIF-1、TGFβ/BMP、FGF和Notch等。此外，生物力学改变和炎症因子（如IL-1β、TNF-α）也参与OA进展。

黄酮类化合物如槲皮素、山奈素（Kaempferide, KA）和表没食子儿茶素没食子酸酯具有抗炎、抗氧化和软骨保护作用。本研究旨在评估KA在OA模型中的治疗潜力，并通过转录组测序分析其作用机制。

Methods

Reagents

KA（纯度≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司，地塞米松（DXM）购自Solarbio公司。实验抗体包括Collagen II、IFN-γ、NF-κB、HIF-1α、VEGF、iNOS、MMP-2、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5、β-actin等。HIF-1α激动剂DMOG和抑制剂LW6由MedChemExpress提供。

Cell viability assay

SW1353细胞（人软骨肉瘤细胞系）以5×10³ cells/well接种于96孔板，经不同浓度KA（1–120 μmol/L）处理24小时后，检测450 nm吸光度并计算半数抑制浓度（IC₅₀）。

Cell culture and OA model建立

细胞以1×10⁵ cells/well接种于6孔板，使用DMEM培养基（含10% FBS）。以10 ng/mL IL-1β处理24小时建立OA模型，分为对照组、OA组、OA+KA低剂量（30 μmol/L）、中剂量（60 μmol/L）和高剂量（90 μmol/L）组。

Western blotting

提取蛋白后通过SDS-PAGE和PVDF膜转移，使用特异性一抗和二抗（HRP标记）孵育，β-actin作为内参，Image J软件分析条带灰度值。

qRT-PCR分析

使用Total RNA Extraction Kit提取RNA，反转录为cDNA后通过qRT-PCR检测基因表达，以2^?ΔΔCt法计算相对表达量。

Transcriptome sequencing

经90 μmol/L KA处理24小时后提取总RNA进行转录组测序，通过HISAT2比对基因组，DESeq2分析差异表达基因（DEGs），并进行GO和KEGG富集分析。

Animal experiments

30只雄性SD大鼠（6周龄）通过关节内注射4% papain和L-半胱氨酸建立OA模型。分为对照组、OA组、OA+DXM（1 mg/kg/周）、OA+KA低剂量（1.5 mg/kg/周）和高剂量（3 mg/kg/周）组，治疗4周后取材分析。

Gait behavior test

评估大鼠在5分钟内的运动距离和站立时间，基线（0周）和治疗后每周记录一次。

Safranin O–Fast Green染色和Mankin评分

关节软骨切片经染色后观察软骨结构，按改良Mankin评分原则评分（0–14分，分数越高表示关节退化越严重）。

Immunohistochemical analysis

石蜡切片经抗原修复后使用Collagen II、MMP13、IFN-γ、HIF-1α、VEGF一抗孵育，DAB显色后计算平均光密度（MOD）。

ELISA

检测细胞上清中COX-2、iNOS、LOX、LTB4和PGE2水平，通过标准曲线计算浓度。

Statistical analyses

使用SPSS软件进行单因素方差分析和Tukey HSD检验，P<0.05为显著差异。

Results

Effects of KA on chondrocyte OA model in vitro

KA在15 μmol/L以上浓度显著抑制SW1353细胞活力，IC₅₀为200.1 μmol/L。在IL-1β诱导的OA模型中，30、60、90 μmol/L KA均显著提高细胞活力（P<0.05）。ELISA显示KA剂量依赖性降低COX-2、iNOS、PGE2、LOX和LTB4水平（P<0.01）。qRT-PCR和Western blotting表明KA降低MMP-2、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5表达，同时增加COL2A1、Aggrecan、SOX9、HAS2表达（P<0.05）。

Effects of KA on chondrocyte OA model in vivo

步态分析显示，治疗4周后KA和DXM组大鼠运动时间和站立时间显著改善（P<0.05），其中高剂量KA组效果最优。大体观察显示OA组软骨表面损伤严重，而KA和DXM组软骨结构改善。Mankin评分表明KA组评分显著低于OA组（P<0.05）。免疫组化显示KA处理减少Collagen II丢失，并降低IFN-γ、HIF1α、VEGF、MMP13表达。

Transcriptomic analysis of KA effects on OA

RNA测序发现OA组vs对照组有1415个DEGs，KA处理调控230个基因。GO分析显示这些基因富集于细胞对氧水平响应、缺氧反应等生物过程，以及细胞因子活性、受体结合等分子功能。KEGG分析突出HIF-1信号通路为关键通路（P<0.05），包括SLC2A1、ENO2、PDK1、EGLN3、IL6、PFKFB3、Tie-2等下调基因。GSEA证实HIF-1通路显著富集（NES=?2.0483, P<0.01）。qRT-PCR验证这些基因在KA处理后表达下降（P<0.05）。

Changes in HIF-1 signaling pathway expression and validation

qRT-PCR和Western blotting显示KA降低IFN-γ、NF-κB、HIF-1α、VEGF、iNOS、Tie2、PFKFB3的mRNA和蛋白表达（P<0.05）。免疫荧光进一步证实KA抑制HIF-1通路关键蛋白表达。NF-κB通路分析表明KA抑制p65和IκBα磷酸化。

通过外源性IFN-γ和抗IFN-γ抗体emapalumab处理，发现IFN-γ上调HIF-1通路基因表达，而KA或emapalumab逆转这一效应（P<0.05），且联合处理效果更显著（P<0.001）。使用HIF-1α激动剂DMOG和抑制剂LW6，证实DMOG激活通路而KA抑制其效应，LW6与KA联用协同抑制通路活性。

Discussion

本研究证实KA通过抑制HIF-1信号通路，降低炎症因子（MMP-2、MMP-3、COX-2、iNOS等）表达，减轻软骨降解并改善关节功能。转录组学分析揭示KA调控SLC2A1、ENO2、PDK1、EGLN3、IL6、Tie2、PFKFB3等基因，其中IFN-γ作为上游调控因子参与HIF-1通路激活。此外，KA抑制NF-κB通路磷酸化，进一步减少炎症反应。

与DXM相比，KA表现出相当的抗炎和软骨保护作用，且在高剂量下效果更优。然而，研究存在局限性：SW1353细胞为肿瘤细胞系，未来需采用原代软骨细胞验证；部分数据库信息滞后可能影响通路分析。综上所述，KA作为一种天然黄酮化合物，具有成为OA疾病修饰药物的潜力，但需进一步研究其稳定性、剂量优化和长期安全性。

Funding

本研究由国家自然科学基金（82102531和82172410）资助。

Conflicts of interest

无。