m6A修饰的circCD2AP通过FOXC1-PARK7轴抑制膀胱癌细胞铁死亡的作用机制与临床意义

　　本研究揭示了m6A甲基化修饰的环状RNA circCD2AP在膀胱癌（BCa）中通过调控FOXC1 mRNA稳定性及PARK7转录活性，抑制铁死亡（ferroptosis）的新型分子机制。METTL3介导的m6A修饰促进circCD2AP表达，YTHDC1介导其胞质转运，进而通过IGF2BP3增强FOXC1稳定性并激活PARK7转录，最终抑制脂质过氧化和GSH耗竭。该轴为BCa治疗提供了潜在靶点，尤其与erastin等铁死亡诱导剂联用具有临床转化前景。

　　

引言

膀胱癌（BCa）作为泌尿系统最常见恶性肿瘤，全球年新发病例达57.3万，死亡21.2万例。其高复发率和治疗抵抗性导致患者预后较差，亟需探索新的发病机制和治疗策略。环状RNA（circRNA）是一类具有共价闭合结构的RNA分子，比线性RNA更稳定，在肿瘤中发挥关键调控作用。circCD2AP（hsa_circ_0076704）在BCa中高表达且与患者总体生存率相关，但其具体功能和机制尚未明确。

N6-甲基腺苷（m6A）是真核细胞中最常见的RNA内部修饰，影响mRNA剪接、降解、翻译和定位等过程。METTL3作为关键甲基转移酶，通过m6A修饰调控下游基因表达，促进BCa进展。YTHDC1作为核内m6A阅读蛋白，介导m6A修饰RNA的核质转运。此外，胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3（IGF2BP3）作为m6A识别蛋白，通过稳定靶mRNA参与肿瘤发生。

叉头框C1（FOXC1）作为转录因子家族成员，在多种肿瘤中激活致癌信号通路。在BCa中，FOXC1表达升高，敲低其表达可抑制肿瘤发展。FOXC1还参与铁死亡调控，但其在BCa中的作用尚未探索。铁死亡是2012年发现的程序性细胞死亡形式，以谷胱甘肽（GSH）耗竭、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性降低、脂质过氧化和活性氧（ROS）积累为特征。帕金森病蛋白7（PARK7/DJ-1）作为ROS清除关键分子，在肿瘤中抑制铁死亡。PARK7在BCa患者中高表达，可作为肿瘤标志物，但其转录调控机制尚不清晰。

方法

研究收集98例BCa组织及癌旁正常组织，所有患者均接受根治性膀胱切除术并经病理确诊。人膀胱上皮细胞SV-HUC-1和BCa细胞系（UM-UC-3、BT-B、T24、5637、J82）在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。使用erastin（10 μmol/L）或RSL3（1 μmol/L）处理细胞，联合liproxstatin-1（铁死亡抑制剂）、ZVAD-FMK（凋亡抑制剂）或necrostatin-1（坏死性凋亡抑制剂）。通过shRNA敲低circCD2AP、METTL3、YTHDC1和FOXC1，或过表达circCD2AP、FOXC1及YTHDC1野生型/突变体质粒。采用荧光原位杂交（FISH）、免疫荧光、MTT法、试剂盒检测MDA、铁、Fe²⁺、GSH水平，流式细胞术分析脂质ROS，MeRIP-PCR检测m6A修饰水平，RNA pull down和RIP验证RNA-蛋白相互作用，ChIP和双荧光素酶报告基因检测FOXC1与PARK7启动子结合。动物实验采用BABL/c裸鼠皮下移植T24细胞，分组处理并检测肿瘤体积、重量及蛋白表达。

结果

circCD2AP在BCa中上调并与铁死亡相关

circCD2AP源自CD2AP基因外显子2-5，长度537核苷酸。其在BCa组织和细胞中显著高表达，且高表达患者生存率低。erastin和RSL3以浓度依赖性抑制细胞活力，敲低circCD2AP增强该效应，而liproxstatin-1可逆转此作用。PARK7在BCa中高表达且与患者不良预后相关，与circCD2AP表达呈正相关。

circCD2AP敲低抑制PARK7信号并促进铁死亡

敲低circCD2AP后，erastin/RSL3处理的细胞中MDA、铁、Fe²⁺水平升高，GSH降低，脂质ROS增加。SLC7A11、GPX4和PARK7蛋白表达下降，表明circCD2AP通过调控PARK7抑制铁死亡。

METTL3通过m6A修饰上调circCD2AP且YTHDC1介导其胞质转运

MeRIP-PCR证实circCD2AP存在m6A修饰。METTL3在BCa中高表达且与circCD2AP正相关。敲低METTL3降低circCD2AP表达和m6A修饰水平。YTHDC1与circCD2AP结合，敲低YTHDC1增加核内circCD2AP，而过表达YTHDC1野生型促进其胞质输出。

METTL3敲低通过抑制circCD2AP/PARK7促进铁死亡

METTL3敲低增强erastin的细胞毒性，降低细胞活力，升高MDA、铁、Fe²⁺和脂质ROS，降低GSH、SLC7A11、GPX4和PARK7，而过表达circCD2AP逆转这些效应。

circCD2AP通过靶向IGF2BP3增强FOXC1 mRNA稳定性

FOXC1在BCa中高表达且与不良预后相关。敲低circCD2AP降低FOXC1 mRNA和蛋白水平。RNA pull down和RIP证实circCD2AP与IGF2BP3结合，IGF2BP3与FOXC1 mRNA相互作用。敲低circCD2AP降低IGF2BP3对FOXC1的富集，并缩短FOXC1 mRNA半衰期。

FOXC1结合PARK7启动子增强其转录

JASPAR预测FOXC1与PARK7启动子两个结合位点（位点1：-1518~-1508；位点2：-1632~-1622）。ChIP验证FOXC1富集于位点1。过表达FOXC1增加PARK7启动子荧光素酶活性和PARK7表达，敲低FOXC1则抑制。

敲低PARK7或FOXC1逆转circCD2AP过表达的抑铁死亡作用

敲低FOXC1或PARK7降低细胞活力，促进MDA、铁、Fe²⁺和脂质ROS积累，降低GSH、SLC7A11、GPX4和PARK7，而circCD2AP过表达抵消这些变化。

体内实验验证circCD2AP/METTL3敲低抑制肿瘤生长

裸鼠实验中，erastin处理抑制肿瘤体积和重量，敲低METTL3或circCD2AP进一步增强该效应，并下调FOXC1、PARK7、SLC7A11、GPX4及Ki-67表达。

讨论

本研究阐明METTL3介导的m6A修饰促进circCD2AP表达，YTHDC1协助其胞质转运，circCD2AP通过结合IGF2BP3稳定FOXC1 mRNA，FOXC1转录激活PARK7表达，从而抑制BCa细胞铁死亡。该轴为BCa提供了新的生物标志物和治疗靶点，靶向circCD2AP/FOXC1/PARK7通路联合铁死亡诱导剂可能改善BCa治疗策略。