适应性疗法利用化疗耐药卵巢癌的适应性缺陷实现长期肿瘤控制

　　本研究发现，基于肿瘤反应调整卡铂剂量的适应性疗法（AT）相比标准卡铂治疗能显著延长小鼠卵巢癌模型的生存期，且不增加日均剂量或毒性。耐药细胞在无药环境下表现出适应性缺陷（如增殖减少和凋亡增加），而敏感细胞在撤药后重新生长。研究还开发了利用拷贝数变异（CNA）追踪耐药演变的生物信息学流程liquidCNA（LiqCNA），通过患者游离DNA（cfDNA）分析证实了治疗过程中的亚克隆选择，且耐药群体增长与疾病负荷强相关。这些发现为针对卡铂耐药演变的个性化AT临床试验奠定了基础。

　　

引言

系统性癌症治疗基于高剂量药物可根除所有恶性细胞的原则，但最大耐受剂量（MTD）化疗常因选择预存耐药亚克隆或癌细胞表型可塑性而失败。耐药细胞群体的出现导致治疗失败。性状进化常存在权衡：癌细胞进化出耐药表型可能以增殖能力下降为代价。药物敏感和耐药细胞的相对适应性因药物治疗而逆转：有药时耐药细胞更适应，无药时敏感细胞更具优势。适应性疗法（AT）是一种利用敏感与耐药亚克隆间竞争相互作用的新治疗范式，旨在维持足够敏感细胞群体以抑制“适应性较差”的耐药细胞增殖。该策略承认在姑息治疗中癌症无法根除，目标是控制而非治愈。

高级别浆液性卵巢癌（HGSC）是最常见的卵巢亚型，标准治疗包括肿瘤减灭术和铂类-紫杉烷化疗，随后在同源重组缺陷群体中使用PARP抑制剂维持。尽管强化治疗，多数HGSC会复发，患者需多线化疗。铂类药物构成治疗支柱，但随每次序贯复发效果递减，最终导致治疗失败。靶向药物和免疫疗法未能改善生存，AT可能为当前MTD治疗失败的不可治愈HGSC患者提供有益策略。先前研究证明卡铂AT对小鼠有益，但其机制基础及与卵巢癌患者的关联尚未阐明。

AT预计在针对新兴耐药群体大小时最有益，但铂耐药机制不明确，缺乏可追踪标记如反复出现的单核苷酸变异或常见拷贝数驱动因子。然而，治疗后HGSC携带新的拷贝数改变（CNA），除已高度改变的基因组外，这些改变似乎具有患者特异性。研究者最近开发了生物信息学流程liquidCNA（LiqCNA），利用这些CNA量化治疗耐药的出现。

材料与方法

化疗耐药细胞系

OVCAR4和Cov318人HGSC细胞在体外培养，通过持续暴露于顺铂（0.5–0.7 μmol/L）8周，创建Ov4Cis和Cov-Cis顺铂耐药细胞系。卡铂耐药OVCAR4细胞（Ov4Carbo）通过递增卡铂剂量（1.5–3.5 μmol/L）建立。细胞用荧光素酶（Luc）和绿色荧光蛋白（GFP，敏感细胞）或红色荧光蛋白（RFP，耐药细胞）慢病毒转染。另通过体内生成卡铂耐药细胞系IVR01：将OVCAR4-GFP细胞腹腔注射， established肿瘤小鼠接受卡铂50 mg/kg腹腔注射每周4次，肿瘤再生后收获创建IVR01。耐药细胞立即扩增，无进一步亚克隆，低传代细胞用于后续实验。

细胞增殖与共培养

使用Incucyte活细胞成像系统量化增殖。对于共培养研究，GFP标记敏感细胞和RFP标记耐药细胞以不同起始比例接种，在10% FBS（标准资源）或0.5% FBS（低资源）条件下传代或每日更换培养基。测量顺铂效应：50:50共培养在10% FBS中接种，24小时后更换为0.5% FBS培养基，第6天添加顺铂（0.1–1 μmol/L），之后每日更换新鲜0.5% FBS培养基。共培养随时间收获，通过流式细胞术测量GFP表达细胞比例。通过PI/RNaseA染色和Annexin V标记评估细胞周期和凋亡。

生长动力学建模

使用Mathematica和PopDynamics计算生长速率和承载能力。通过最低敏感接种比例（高资源5:95，低资源15:85）拟合敏感:耐药（S:R）比率对数随时间变化，线性模型斜率测量g = g_s ? g_r。其他接种比例数据集对齐，使每个数据集首时间点落在线条上。

条件培养基测定

在六孔板中接种OVCAR4-GFP或Ov4Cis细胞，每日更换由同种细胞系、相反细胞系或50:50 OVCAR4-GFP:OV4Cis-RFP共培养预条件24小时的0.5% FBS培养基。收获细胞并计数。

PCR

使用DNeasy Kit提取DNA，通过qPCR定量GFP和RFP DNA，归一化至人GAPDH。通过RT-PCR定量mRNA，归一化至β-肌动蛋白，多柔比星处理细胞作为阳性对照。

动物研究

实验在英国Home Office项目许可证P1EE3ECB4下进行，经机构审查委员会批准。6周龄雌性CD1^nu/nu小鼠腹腔或皮下双侧注射5×10⁶细胞。使用卡尺测量肿瘤[体积=π(短径)²×(长径)/6]。当任一侧腹肿瘤体积达1.44 cm²、实验终点或达到项目许可证最大严重度时，通过Schedule 1方法处死动物。

AT实验

入组标准包括小鼠有一个皮下肿瘤（目标肿瘤）≥300 mm³。小鼠随机分配至(i) vehicle（200 μL PBS腹腔注射每4天×3剂量）；(ii) 标准治疗（60 mg/kg卡铂腹腔注射每4天×3剂量）；(iii) AT：初始剂量60 mg/kg卡铂腹腔注射，然后每周腹腔注射卡铂（根据图表）。非目标肿瘤大小从不用于决定药物剂量。每日监测小鼠，每周称重。如果任一侧腹肿瘤（目标或非目标）达1.44 cm²或小鼠体重减少>15%起始体重，根据许可证处死动物。

IHC

肿瘤在4%多聚甲醛中固定。4 μm切片脱蜡、水化，用3% H₂O₂处理，并进行抗原修复（Tris-EDTA, pH 9.0, 95°C）。用PBS+5%山羊血清和1% BSA封闭（室温1小时）。一抗（室温1小时）：p53、GFP、抗裂解caspase-3和荧光素酶。应用生物素化二抗和链霉亲和素-过氧化物酶（室温45分钟），苏木精复染。幻灯片数字化（Hamamatsu NanoZoomer-XR）。使用Adobe Photoshop量化p53+和GFP+像素。

患者样本

从III/IV期HGSC患者收集肿瘤组织和血液。所有患者在Barts Gynae组织库伦理（REC: 20/EE/0193）下提供书面知情同意，符合赫尔辛基宣言并经机构审查委员会批准。血液收集于10 mL Cell-Free DNA BCT（Streck）管中，4小时内离心（1,200×g, 10分钟, 40°C）；上清-80°C储存用于cfDNA提取。细胞（白细胞）沉淀-80°C储存用于种系DNA提取。

DNA提取与分析

用红细胞裂解缓冲液处理白细胞沉淀，基因组DNA通过DNeasy Blood and Tissue Kit（Qiagen）提取。从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织通过激光捕获显微切割后提取DNA[High Pure FFPET DNA Isolation Kit（Roche）]。基因组和组织DNA片段化（Covaris M220），使用NEBNext FFPE DNA Repair Mix和NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina（New England Biolabs Inc）制备文库。cfDNA提取和文库制备使用QIAseq cfDNA All-in-One Kit（QIAGEN）。文库用Illumina NovaSeq 6000测序（平均深度：白细胞0.3×，组织0.5×，cfDNA 1.9×）。读取比对至hg19。使用QDNAseq获得拷贝数谱，并用LiqCNA分析以获得肿瘤纯度和估计耐药群体。每个患者在随机75%基因组片段子样本上运行LiqCNA 150次，以得出每个亚克隆比率估计的95%置信区间。

统计分析

使用GraphPad Prism v7.04分析。显著性水平：P < 0.05；P < 0.001；P < 0.0001。Pearson R和R²用于测量线性相关和拟合。除非另有说明，使用配对双尾t检验。

数据可用性

本研究生成的基因组学数据公开于European Genome-Phenome Archive（EGA）EGAS50000001142。患者样本的拷贝数谱和liquidCNA算法输出公开于https://doi.org/10.17632/m93sk9n767.1或https://data.mendeley.com/datasets/m93sk9n767/1。所有其他原始数据可根据要求从通讯作者处获得。

结果

建立铂耐药HGSC细胞系面板

从两个反映人HGSC基因组特征的细胞系（OVCAR4和Cov318）进化出铂耐药HGSC细胞。这些铂耐药细胞系从预存祖先克隆进化而来，与人HGSC类似，它们不共享药物耐药的突变原因，但进化出与复发患者数据集显著重叠的基因表达变化。敏感细胞用荧光素酶（Luc）和GFP（敏感细胞）或RFP（耐药细胞）转染。

卡铂AT显著延长荷瘤小鼠生存期

为测试体内AT，使用祖先OVCAR4细胞（铂敏感）和Ov4Carbo（卡铂耐药），因两者在小鼠中形成肿瘤。Ov4Carbo（非OVCAR4）用RFP/荧光素酶（Ov4Carbo-Luc）转染以通过生物发光成像追踪耐药群体随时间变化。在雌性裸鼠双侧腹皮下生长肿瘤，使用OVCAR4细胞（敏感）、Ov4Carbo-Luc（耐药）或80:20 OVCAR4:Ov4Carbo-Luc共培养。监测小鼠并按材料与方法处理。标准卡铂治疗（ST）与Gatenby等开创性AT文章方案相同（60 mg/kg卡铂腹腔注射每4天3剂量）。AT方案基于先前研究，根据肿瘤大小变化每周腹腔注射给药。计算从初始肿瘤细胞注射时间起的中位生存期。

所有vehicle和ST治疗小鼠在实验结束前达到人道终点。ST在多数敏感肿瘤（OVCAR4和80:20 OVCAR4:Ov4Carbo-Luc）中暂时停止肿瘤生长，但治疗停止后所有肿瘤再生，这两组生存期无差异。相反，在Ov4Carbo-Luc肿瘤（耐药）小鼠中，ST后中位生存期5.75周对比vehicle 15.25周（P=0.09）。AT改善生存对比ST。在Ov4Carbo-Luc肿瘤（耐药）小鼠中，AT增加生存对比ST（P=0.04），但所有小鼠仍在AT期间进展，8周前达到人道终点。在OVCAR4肿瘤（敏感）小鼠中，AT后中位生存期未定义因该组死亡太少，对比ST 18.75周（P=0.01）。一只OVCAR4 AT治疗小鼠因不明体重损失在治疗开始15周后处死，尸检未发现肿瘤。其他四只小鼠无肿瘤生长存活至实验终点（20周）。在80:20 OVCAR4:Ov4Carbo-Luc肿瘤小鼠中，AT也实现持久肿瘤控制，中位生存期未定义，对比ST后中位生存期11.25周（P=0.06）。

两只AT治疗80:20肿瘤小鼠在实验终点前达到Home Office限制（治疗开始后4和13.5周），因大出血肿瘤。两者均与最低点相比光输出（生物发光成像）增加，尽管第二只小鼠在死亡当天（13.5周）光输出再次减少。组织学显示，4周死亡小鼠肿瘤以耐药、荧光素酶表达细胞为主。13.5周死亡小鼠增大肿瘤为囊性，中央坏死核心，可能解释终点光输出减少。

所有AT治疗小鼠接受比ST小鼠更高的累积卡铂剂量。在OVCAR4和80:20肿瘤小鼠中，总卡铂剂量随时间平稳因肿瘤受控，以致后期每周卡铂完全省略（三只小鼠）或反复以极低剂量（<3 mg）给药。尽管耐药肿瘤（Ov4Carbo-Luc）仍生长 despite 增加的累积卡铂，AT延长生存意味着每日总卡铂剂量显著低于ST。在OVCAR4和80:20肿瘤小鼠中，两组间每日卡铂剂量无显著差异。动物体重在ST和AT间可比。唯一潜在治疗相关毒性是一只AT治疗动物（13只中）不明体重损失导致早期死亡。AT因此耐受良好，显著改善生存对比ST，不增加日均卡铂暴露。

耐药HGSC群体在低资源条件下表现出适应性降低

为探索耐药癌细胞适应性降低的假设，创建体外共培养：在10% FBS中接种OVCAR4（敏感）与Ov4Cis（耐药）在不同S:R比例，“标准资源”下每周传代两次。共培养随时间收获，敏感/耐药群体定量。在所有情况下，耐药细胞群体随时间增加。S:R细胞比率减少速率所有接种比例相似，所有数据点接近最佳拟合线，证明标准资源条件下无竞争独立生长。

由于权衡预计在资源受限时发生，测试0.5%血清培养基中的生长。当细胞维持无培养基更换时，0.5%与标准10%血清间初始生长速率无差异。然后比较长期无传代培养在0.5%血清培养基中，无论无培养基更换或每日更换新鲜0.5%血清培养基。OVCAR4和Ov4Cis细胞在两种血清条件下进入逻辑生长；然而，当细胞维持无培养基更换时，两者丰度第11天后迅速减少。每日培养基更换允许更快生长速率、更高承载能力和延长两者生存。0.5% FBS每日培养基更换因此用于所有后续体外实验（“低资源”）以维持共培养更长实验期。

OVCAR4和Ov4Cis然后在低资源条件下以三种起始比例共培养。对于所有比例，耐药细胞存在不影响敏感细胞生长，但敏感细胞存在减慢生长并降低耐药细胞丰度对比单培养。在这些低资源条件下，混合敏感/耐药群体生长速率为逻辑，并偏离早期时间点预期生长，表明群体竞争资源尽管承载能力限制实验后期总群体大小。进一步分析证明耐药细胞生长速率低于敏感细胞（g_s ? g_r = 0.08倍/天），并保持独立于初始S:R细胞比例。这证明耐药细胞在低资源条件下承担的适应性成本，并显示有限资源竞争惩罚耐药癌细胞。

低资源共培养在另外三对S:R HGSC细胞对中重复：OVCAR4:Ov4Carbo、OVCAR4:IVR01和Cov318:Cov-Cis。两种卡铂耐药细胞系Ov4Carbo（体外进化）和IVR01（体内进化）的生长和丰度因敏感细胞存在而减少，承载能力处竞争更强。在Cov318:Cov-Cis对中，生长速率和承载能力在单培养和共培养中可比，竞争总是对丰度较低细胞系影响更大。

共培养诱导耐药HGSC细胞凋亡

为检查耐药群体在低资源共培养中下降的机制，OVCAR4（敏感）和Ov4Cis（耐药）细胞以100%单培养或85%:15% S:R共培养生长，通过FACS获取细胞周期谱至13天。OVCAR4细胞在共培养对比单培养任何细胞周期阶段比例无显著变化。相反，对比Ov4Cis单培养，更多Ov4Cis细胞在共培养中似乎处于亚G₀，更少Ov4Cis处于G₂–M期。对比OVCAR4，也有更多Ov4Cis细胞处于亚G₀和更少Ov4Cis细胞处于G₂。一起，这暗示Ov4Cis细胞当与OVCAR4细胞在低资源共培养时经历凋亡和减少增殖。

为进一步表征凋亡，低资源共培养通过添加标准凋亡标记Annexin V重复。Annexin V在OVCAR4和Ov4Cis单培养中可比，不随时间变化。在OVCAR4细胞中，Annexin V染色不受耐药细胞存在影响。相反，在Ov4Cis细胞中，Annexin V随敏感群体大小增加逐渐增加。这在后期时间点最显著，表明耐药细胞在低资源共培养中随时间凋亡增加。

OVCAR4和Ov4Cis细胞然后在低资源条件下以100%单培养或50:50共培养生长。每日更换培养基如前，用从同种细胞系、另一种细胞系或50:50共培养获得的预条件培养基。OVCAR4生长再次超过Ov4Cis，但条件培养基不影响任何细胞培养的生长速率或承载能力，暗示耐药细胞群体在共培养中减少生长不是由分泌因子诱导。为研究衰老作为耐药细胞群体减少的可能原因，再次在低资源条件下接种共培养，并通过qRT-PCR测量标准衰老标记p16和p21。尽管多柔比星在Ov4Cis细胞中诱导p21，低资源共培养长达13天未在任一种细胞系中诱导p16或p21。

耐药细胞与敏感细胞共培养时体内增殖减少

接下来表征体内敏感/耐药群体间竞争。由于体内较体外实验时间过程更长，首先测量体外传代期间GFP和RFP表达的FACS。尽管GFP荧光保存20代，RFP荧光随时间减少。为解决此，使用qPCR定量共培养细胞中GFP/RFP，并观察qPCR与已知OVCAR4（S）和Ov4Cis（R）细胞输入值间密切关联（R²=0.99）。然后混合OVCAR4和Ov4Cis细胞，通过小鼠双侧腹注射细胞混合物创建皮下肿瘤。小鼠12周处死，从皮下共培养肿瘤提取肿瘤DNA。通过qPCR定量GFP（敏感）和RFP（耐药），并对标标准曲线。在所有肿瘤中，终点敏感群体超过初始注射比例，而耐药群体低于起始比例，表明无药物治疗下体内敏感细胞优先生长。

为表征体内敏感/耐药群体时间动态，小鼠双侧腹皮下注射OVCAR4和Ov4Cis混合物，起始比例50:50或80:20。每组四只小鼠在4、8和12周处死。通过qPCR在预接种细胞混合物和终点收获肿瘤中量化S:R细胞比例。再次，在所有时间点和两种起始比例，GFP DNA增加而RFP DNA减少对比输入比例（时间=0）。

来自 Supplementary Fig. S8 中50:50 OVCAR4-GFP:Ov4Cis-RFP肿瘤小鼠的对侧腹肿瘤通过IHC染色p53指示肿瘤和GFP指示铂敏感肿瘤细胞。由于RFP（非GFP）蛋白表达随时间丢失，耐药Ov4Cis细胞由p53+、GFP阴性染色指示。小的离散GFP阴性耐药细胞岛嵌入GFP+肿瘤结节中。耐药细胞的空间连续性暗示它们是克隆扩张，而非存活细胞 conglomerate。而且，在检查的五个肿瘤结节中11个GFP阴性簇，仅一个位于肿瘤外围，仅一个邻近坏死区域，支持我们先前发现耐药细胞在低资源条件下适应性较差。与我们体外数据一致，凋亡标记裂解caspase-3阳性最明显在耐药、GFP阴性细胞中，尽管并非总是如此。与我们其他发现一致，敏感和耐药群体量化再次证明GFP阳性敏感群体随时间增加并超过初始注射50%，而GFP阴性耐药群体下降。

敏感和耐药HGSC群体在治疗期间动态生长和下降

为追踪化疗对敏感/耐药群体的影响，50:50 OVCAR4（敏感）:Ov4Cis（耐药）细胞共培养在低资源条件下体外生长。第6天单剂量顺铂（0–1 μmol/L）给药，24小时后在下一次 scheduled 低血清培养基更换时洗脱。S:R细胞比例随时间测量。如前，敏感细胞生长超过耐药细胞，五个实验间预处理生长速率有微小生物学变异。药物治疗总是在暴露后几天减少敏感细胞比例（范围：5–12天）。这种关系剂量依赖，以致更高顺铂剂量在更早时间点看到更大敏感群体减少。在所有情况下，敏感细胞随后 outgrew 耐药 ones，推测因药物效应 wear off，证明敏感/耐药群体相对大小在治疗期间动态变化。

卡铂耐药群体可在HGSC患者cfDNA中追踪

循环肿瘤标志物如HGSC中CA125估计总肿瘤负荷，但AT预计在针对耐药群体生长时最有效。目前，无生物标志物估计卡铂耐药。为解决此，应用我们的生物信息学流程LiqCNA到ST期间五名HGSC患者的序贯血液和组织样本。LiqCNA识别新兴耐药亚克隆中存在的CNA，并推断该亚克隆频率。这五名患者中三名在≥3时间点采样（患者1、2和3），两名在两个时间点采样（患者4和5）。我们注意仅两个样本，LiqCNA不能可靠区分 pervasive 持续拷贝数不稳定性和来自 exclusively 在亚克隆中存在的CNA的测量偏差。因此，患者4和5中亚克隆比率可能高估。

CNA谱显示耐药特异性变化通过治疗出现（患者1；患者2–5），并使量化新兴耐药群体在所有五例中可能。新兴耐药群体中最显著CNA显示，连同包含在新兴耐药特异性CNA中的已知致癌驱动因子和与卵巢癌相关基因。观察到拷贝数变化的基因组区域和LiqCNA算法调用在患者间不同。

然后比较每个患者随时间LiqCNA计算的新兴耐药群体变化与CA125变化。这些患者呈现HGSC不同表现，两名显示典型复发/缓解病程（患者1和2），两名显示最小铂敏感性和差生存（患者3和4），一名（患者5）演示中间病程，重复药物反应但持续高 volume 疾病。临床细节提供于 Supplementary Table S2。我们发现两序贯样本中推断的新兴耐药群体生长速率与 later LiqCNA估计时绝对CA125间强相关（R=0.94, P=0.00015）。LiqCNA耐药群体生长测量因此与疾病负荷强相关。而且，在三名三个时间点LiqCNA读数的患者（患者1、2和3），更高LiqCNA读数后跟随疾病进展或更短时间至下次治疗。一起，这暗示LiqCNA可能提供循环标志物追踪铂耐药和指导未来AT临床试验中的剂量调整。

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