PD-1抑制剂帕博利珠单抗联合瘤内注射非毒性诺维氏梭菌（C. novyi-NT）治疗晚期实体瘤的Ib期研究：探索缺氧肿瘤微环境的免疫治疗新策略

　　本综述重点探讨了PD-1抑制剂帕博利珠单抗（pembrolizumab）与瘤内注射非毒性诺维氏梭菌（C. novyi-NT）孢子联合治疗晚期实体瘤的Ib期临床研究（NCT03435952）。研究证实该联合方案安全性可控，最大耐受剂量（MTD）为100×104孢子，客观缓解率（ORR）达25%，中位缓解持续时间10.93个月。该策略通过靶向肿瘤缺氧区域激发免疫原性细胞死亡（ICD），增强T细胞浸润和细胞因子（如IFNγ、TNFα）释放，为免疫治疗耐药患者提供新方向。

　　

研究背景

肿瘤缺氧区域的存在是癌症治疗中的主要挑战之一，这些区域与更具侵袭性的肿瘤生长、转移风险增加以及对化疗和放疗的抵抗性相关。缺氧可通过改变与肿瘤进展和治疗反应相关的基因和蛋白质表达来促进肿瘤恶化。近年来，利用溶瘤细菌（如梭菌属物种）进行瘤内治疗的新方法受到广泛关注。非毒性诺维氏梭菌（C. novyi-NT）是一种革兰阳性、严格厌氧的芽孢形成细菌，通过剔除α-毒素（alpha-toxin）显著改善安全性，并保留在肿瘤缺氧区域选择性定植和复制的能力，从而引发免疫介导的抗癌反应。

临床前研究表明，瘤内注射溶瘤病毒或细菌与免疫检查点抑制剂的联合应用可显著增强抗癌疗效。例如，瘤内注射副流感病毒（新城疫病毒）与全身性抗CTLA-4抗体伊匹木单抗（ipilimumab）联合在结肠癌和黑色素瘤体内模型中引发深刻的免疫介导反应。类似地，静脉注射柯萨奇病毒A21（Coxsackievirus A21）与全身性PD-1抗体联合在黑色素瘤模型中也显示出协同效应。临床研究中，瘤内注射塔利莫基因拉赫帕雷维克（talimogene laherparepvec）与伊匹木单抗联合治疗晚期黑色素瘤患者的客观缓解率（ORR）达到50%，远高于任一单药治疗的预期效果。此外，瘤内注射柯萨奇病毒A21与全身性帕博利珠单抗联合治疗晚期黑色素瘤的Ib期研究中，ORR达到47%。

基于这些发现，本研究假设瘤内注射C. novyi-NT与静脉注射帕博利珠单抗联合可通过增强和维持肿瘤局部的细胞溶解作用，以及引发强烈的宿主免疫和炎症反应，最终导致免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD），从而协同增强抗癌疗效。

患者与方法

本研究是一项开放标签、单中心的Ib期研究（NCT03435952），在德克萨斯大学MD安德森癌症中心进行。研究纳入年龄≥18岁、经组织学诊断为晚期或转移性实体瘤、且存在适合经皮注射C. novyi-NT孢子的肿瘤病灶的患者。注射肿瘤的纵向直径需≥1 cm且≤12 cm，且不能位于胸腔、腹腔或盆腔腔内。关键排除标准包括任何影响C. novyi-NT感染清除的条件，如无脾症、并发免疫抑制治疗或多个抗生素敏感/过敏史。

研究采用3+3剂量递增设计，共设四个剂量组：C. novyi-NT孢子剂量分别为3×10⁴、10×10⁴、30×10⁴和100×10⁴，帕博利珠单抗固定剂量为200 mg静脉注射，每3周一次。主要目标是表征联合治疗的安全性、剂量限制性毒性（DLT）和最大耐受剂量（MTD）。关键次要终点包括评估注射肿瘤病灶的初步抗肿瘤活性以及根据RECIST v1.1标准评估的整体系统反应。

毒性根据NCI常见不良事件评价标准（CTCAE）4.03版进行评估。DLT定义为任何持续至少3天的3级不良事件或任何持续时间的4级不良事件，被认为可能与C. novyi-NT相关，并在C. novyi-NT和帕博利珠单抗给药后4周内出现。此外，DLT还包括任何需要侵入性干预（如经皮脓肿引流）或导致住院时间延长（>5天）的C. novyi-NT感染。

结果

患者特征

2018年7月至2022年9月期间，共有16例晚期难治性实体瘤患者入组。患者中位年龄为62.5岁（范围40-71岁），主要肿瘤类型包括乳腺癌（n=5；31%）和黑色素瘤（n=3；19%）。11例患者（69%）为女性，所有患者（100%）的东部肿瘤协作组（ECOG）体能状态均为1。8例患者（50%）曾接受过免疫检查点抑制剂（ICI）治疗，5例患者（31%）曾接受超过5线全身治疗。

安全性评价

所有16例患者均可用于安全性和DLT评估。10例患者（63%）经历了至少1次1级或2级治疗相关不良事件（TRAE），仅1例患者出现DLT（3级注射部位脓肿形成）。最常见的1级和2级TRAE包括注射部位反应（25%）、发热（19%）、瘙痒（13%）、白细胞减少（13%）和贫血（13%）。与C. novyi-NT特异性相关的不良事件包括4例患者出现注射部位反应（由C. novyi-NT萌发引起）。C. novyi-NT萌发（感染）的体征和症状包括发热、注射部位疼痛、红斑、肿胀，以及在某些情况下出现溃疡、自发性引流、组织脱落、出血和恶臭。

严重不良事件（SAE）发生在6例患者中，其中1例治疗相关SAE发生在剂量水平4，与C. novyi-NT相关的3级注射部位脓肿形成相关，需要住院和医疗干预，这也是本研究中观察到的唯一DLT。其他非治疗相关SAE包括1例患者因疾病进展出现3级呼吸困难需要住院；另1例患者因疾病进展出现注射肿瘤部位3级出血；1例患者出现3级吸入性肺炎和败血症需要住院；1例患者因疾病进展出现恶性胸腔积液导致3级呼吸困难需要住院；还有1例患者出现与治疗无关的3级关节痛需要住院。值得注意的是，仅1例患者因帕博利珠单抗引起的2级免疫相关皮炎（对紫外线光疗和局部类固醇治疗无效）而退出试验。

疗效评价

所有16例患者均可用于疗效评估。 waterfall图显示了四个剂量组和不同肿瘤组织学的最佳总体RECIST v1.1反应以及注射病灶的最佳反应。在16例患者中，观察到3例（19%）部分缓解（PR）和1例（6%）完全缓解（CR），确认的ORR为25%。CR见于1例ICI难治性外阴黏膜黑色素瘤患者（MDA017），缓解持续时间为14.8个月。PR包括1例ICI初治鼻咽癌患者（MDA014），其目标病灶最佳缓解为PR（-87%），缓解持续时间为18.1个月；1例ICI初治脊索瘤患者（MDA019），注射病灶确认PR（-40%），目标病灶确认PR（-37%），缓解持续时间为7.06个月；以及1例人乳头瘤病毒（HPV）阳性舌根鳞状细胞癌患者（MDA010），目标病灶确认PR（-33%），缓解持续时间为2.8个月。缓解患者的中位缓解持续时间为10.93个月（范围2.8-18.1个月），其中1例患者（25%）有既往ICI暴露史。

所有患者的中位注射肿瘤大小为2.65 cm（范围1-11），注射病灶的确认ORR为19%（2例PR和1例CR）。截至2023年6月30日数据截止时，5例患者（31%）仍然存活，9例患者（56%）死亡，2例患者生存状态未知。11例患者（69%）的目标病灶达到疾病稳定（SD），9例患者（56%）的注射病灶达到SD作为最佳反应。1例患者（6%）的目标病灶出现临床进展（PD），4例患者（25%）的注射病灶出现PD作为最佳反应。

中位总生存期（OS）为13.0个月（95% CI，7.9-未达到），3个月、6个月和12个月的中位OS率分别为93.8%、87.1%和53.4%。中位无进展生存期（PFS）为3.6个月（95% CI，2.1-8.2），2个月、3个月和4个月的中位PFS率分别为81.2%、56.2%和43.8%。

宿主免疫和炎症反应

通过分析血清蛋白质水平，评估了患者对C. novyi-NT治疗的免疫和炎症反应。结果显示，应答者和非应答者之间在白细胞介素（IL）-10、IL-15、IL-18、肿瘤坏死因子α（TNFα）和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP1）等蛋白的表达上无统计学差异。类似地，干扰素（IFN）家族成员也未显示显著差异。血管内皮生长因子（VEGF）-C在肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移中起关键作用，其在第3、5和7天呈现轻微升高但统计学不显著的趋势。VEGF-A是一种与VEGFR-1和VEGFR-2相互作用的内皮生长因子，是本次分析中唯一在应答者中显示显著上调（P<0.05）的蛋白，发生在C. novyi-NT治疗后第3天。

肿瘤抗原刺激的T细胞IFNγ、TNFα和颗粒酶B（granzyme B）释放通过ImmunoSpot同时测量。可获得连续外周血单核细胞（PBMC）样本的6例患者中（2例应答者，4例非应答者），应答者患者MDA014在抗原刺激后表现出肿瘤特异性T细胞反应性，伴随TNFα和颗粒酶B分泌增加；IFNγ反应较不一致。患者MDA010显示短暂的T细胞反应性增强，主要归因于帕博利珠单抗。4例非应答者的T细胞反应性在TNFα、颗粒酶B和IFNγ方面不一致。

通过免疫组织化学（IHC）检测注射和非注射肿瘤中T细胞和调节性T细胞标志物（CD3、CD8和FOXP3）的表达，发现淋巴细胞浸润在肿瘤活检中是可变的且患者依赖性，主要限于肿瘤边缘。在临床应答者MDA019和MDA010的非注射肿瘤中检测到淋巴细胞浸润增加。

全血厌氧培养

全血厌氧培养的主要目的是监测患者的全身暴露于C. novyi-NT的情况。共收集189份培养物进行分析，2例患者分别在第14天和第9天检测到C. novyi-NT阳性培养结果，其他所有培养结果均为阴性。

讨论

本研究结果强调了C. novyi-NT与帕博利珠单抗联合治疗在四个剂量组中的安全性。值得注意的是，MTD被确定为帕博利珠单抗静脉注射200 mg每3周一次和瘤内注射100×10⁴C. novyi-NT孢子。不良事件主要为1级或2级，具有可管理的TRAE，仅1例患者出现3级注射部位脓肿形成的DLT。SAE仅在6例患者中观察到，包括1例与C. novyi-NT相关的治疗相关SAE。重要的是，仅1例患者因帕博利珠单抗相关不良事件退出试验。

联合治疗的疗效评估显示确认的ORR为25%，应答者涵盖多种组织学类型。完全和部分缓解均被观察到，突出了联合治疗潜在的转化协同效应。缓解患者的中位缓解持续时间令人鼓舞，达到10.93个月，尽管面临多种“热”和“冷”实体瘤的挑战，但无论既往ICI暴露情况如何，均显示出抗肿瘤功效。

帕博利珠单抗的加入与C. novyi-NT在肿瘤缺氧区域内选择性复制的能力协同作用，导致肿瘤细胞溶解死亡和局部炎症。这增加了新抗原负荷，从而产生持久的免疫反应。帕博利珠单抗通过阻断免疫检查点通路增强T细胞活性，而C. novyi-NT诱导的肿瘤溶解释放肿瘤抗原，可能增强免疫反应。联合应用可能导致抗原呈递增加和随后的T细胞激活。

肿瘤免疫微环境影响联合治疗的结果，突显了实现成功免疫激活的复杂性。免疫抑制微环境的肿瘤可能阻碍有效治疗。然而，联合治疗对免疫细胞浸润的影响，包括T细胞、巨噬细胞和树突状细胞的增加，可能克服免疫抑制环境。这种现象表明该疗法可能重塑免疫 landscape，营造更有利的抗肿瘤环境。

研究C. novyi-NT与帕博利珠单抗联合治疗背景下持续T细胞因子释放和持久免疫记忆的能力，揭示了其具有持久的治疗影响的显著潜力。强大免疫反应的启动有可能在治疗期后持续存在，形成防止肿瘤复发和转移进展的屏障。这种以记忆为中心的现象不仅具有改变疾病固有轨迹的力量，而且使联合治疗成为实现长效抗肿瘤效果的动态力量。值得注意的是，肿瘤抗原刺激的T细胞IFNγ、TNFα和颗粒酶B细胞因子在每周3次帕博利珠单抗给药后继续在PBMC中保持持续和增量水平，甚至在鼻咽癌患者（MDA014）的第336天仍可检测到，该患者确认的总体反应为PR（-87%），并持续长达2年直至研究完成。

本研究存在一些局限性。研究中仅使用单次注射C. novyi-NT孢子到一个肿瘤中，转化读数数量非常有限。尽管单剂量C. novyi-NT可导致显著的肿瘤细胞溶解，但可能不足以逆转转移性疾病的进程。未研究缺氧或肿瘤耐药标志物以进一步了解潜在机制以及与肿瘤缺氧环境的协同作用。此外，在四分之三的应答者中肿瘤突变负荷未知，限制了探索其与治疗反应相关性的能力。

结合C. novyi-NT和帕博利珠单抗与其他治疗方式的前景为更广泛的治疗策略打开了大门。整合靶向治疗、其他免疫疗法或放疗可能潜在地放大治疗效果。通过靶向TME的多个方面，这种组合方法可能为多方面的和强大的抗肿瘤效果铺平道路。

总之，本研究确立了瘤内注射C. novyi-NT与全身帕博利珠单抗联合治疗晚期实体瘤患者的安全性和有效性。我们观察到可管理的不良事件、有希望的缓解率和转化免疫反应，支持C. novyi-NT与帕博利珠单抗之间的潜在协同作用。这些结果强调了这种联合治疗应对肿瘤内缺氧区域挑战的潜力。在更大规模的随机研究中进行进一步探索将为这一方法在不断发展的溶瘤细菌治疗领域中的效用和潜在应用提供更深入的见解。