Licochalcone D通过调节活性氧减轻H2O2诱导的SH-SY5Y细胞神经毒性：神经保护机制研究

　　本研究揭示了Licochalcone D（LCD）通过抑制活性氧（ROS）生成、恢复线粒体功能并调控p38 MAPK凋亡通路，显著减轻H2O2诱导的SH-SY5Y细胞神经毒性，为天然化合物治疗神经退行性疾病提供了新的机制依据和潜在治疗策略。

　　

1 Introduction

氧化应激是神经退行性疾病的主要致病因素之一，通过多种凋亡机制导致神经元损伤。过量活性氧（ROS）水平引起的氧化应激是神经损伤的主要原因，有助于阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿病、帕金森病和中风等神经退行性疾病的发展。天然化合物因其副作用较少，作为治疗各种疾病的潜在替代品受到关注。抗氧化防御系统在控制氧化应激中发挥重要作用，天然产物可通过多种机制保护神经细胞免受氧化应激。

人体中约有4%–5%的氧气通过生物还原剂转化为ROS。ROS包括超氧阴离子、H₂O₂和OH^?自由基，具有高反应性，通过破坏关键生物分子功能、引起线粒体功能障碍、细胞损伤并最终导致细胞死亡，在神经元变性中发挥核心作用。因此，减少ROS产生可能为预防和治疗这些疾病提供有前景的策略。它们的水平受主要抗氧化剂调节，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶，从而维持稳态。然而，在氧化应激下，由于不稳定的抗氧化机制，体内维持过量的ROS，从而破坏稳态。H₂O₂作为一种低反应性自由基和ROS，参与炎症过程并对多种细胞类型具有细胞毒性。它通过芬顿反应产生高反应性OH^?自由基来损伤细胞，其中它被铁或铜等金属离子还原形成高反应性和有害的羟基自由基。尽管这使得H₂O₂对神经细胞具有细胞毒性，但抗氧化剂可以逆转这种作用。

甘草是一种传统草药，常用于东亚治疗各种疾病。据报道，甘草提取物（每公斤体重1克提取物）具有神经保护作用。Licochalcone D（LCD）从甘草中提取，是一种基于类黄酮的生物活性成分。LCD通过多种途径在皮肤癌、口腔癌和肺癌等癌症中发挥抗癌作用。通过其AMPK活性，它发挥抗氧化、抗衰老和心脏保护作用。本研究在体外检查了其对H₂O₂诱导的神经毒性的神经保护作用。

2 Materials and methods

试剂和材料来源如下：Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、胰蛋白酶/EDTA、胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素来自Gibco；磷酸盐缓冲盐水（PBS）来自Corning；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、视黄酸（RA）和二甲基亚砜来自Sigma-Aldrich；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）来自Invitrogen；抗βIII-微管蛋白一抗来自Abcam；Cell Counting Kit-8来自Dojindo；CytoTox 96非放射性细胞毒性测定试剂盒和BCA蛋白测定试剂盒来自Promega；RIPA裂解缓冲液来自Rockland Immunochemicals；LCD（99.95%纯度）来自Selleckchem。

SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系来自韩国细胞库。细胞在补充有生长培养基（10% FBS和1%青霉素/链霉素）的DMEM中于37°C、5% CO₂的湿润气氛中培养24小时。然后将培养基更换为分化培养基（含有1% FBS和10 μM RA的DMEM），并将细胞分化5天。分化培养基在3天后更换。分化的细胞用LCD预处理3小时，然后暴露于H₂O₂。

使用CCK-8测定评估细胞活力。SH-SY5Y细胞（3.5 × 10⁴细胞/孔）在96孔板中培养和分化，并用0.5、1或2 μM LCD预处理3小时，然后用25 μM H₂O₂孵育24小时。然后向每孔加入10 μL CCK-8溶液，在37°C、5% CO₂下孵育3小时。使用酶标仪在450 nm处测量吸光度。

通过测量LDH从细胞质释放到培养基中来评估细胞毒性。细胞以每孔3.5 × 10⁴个细胞接种在96孔板中并培养24小时，然后用稀释在含有1% FBS的培养基中的RA处理并分化5天。在用H₂O₂处理24小时之前，细胞用不同浓度的LCD预处理3小时。阳性对照用裂解缓冲液在37°C孵育40分钟裂解。每个样品等分试样与50 μL CytoTox 96试剂在25°C黑暗中孵育30分钟。为了终止反应，向每孔加入50 μL终止溶液。在反应停止后1小时内测量490 nm或492 nm处的吸光度。

使用细胞渗透性荧光氧化还原探针2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）评估细胞内ROS活性。细胞以3.5 × 10⁴细胞/孔的密度接种在96孔板中，并用10 μM视黄酸（RA）分化5天。细胞用载体或LCD预处理3小时，并向每孔加入20 μM DCFH-DA 30分钟。NAC处理采用与LCD相同的方法。随后，用PBS洗涤细胞，并用25 μM H₂O₂和50 μM叔丁基过氧化氢（TBHP）处理。TBHP用作阳性对照以验证实验结果。在37°C孵育1小时后，使用酶标仪在485和535 nm处测量细胞内ROS水平。使用Operetta CLS高内涵成像系统在20倍放大下捕获荧光图像，使用EGFP通道可视化细胞内ROS相关荧光。

通过使用荧光染料5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′-四乙基苯并咪唑羰菁碘化物（JC-1；Invitrogen）监测线粒体膜电位来评估线粒体功能。细胞不用LCD（对照或H₂O₂处理）或用不同浓度（0.5、1和2 μM）LCD预处理3小时，然后用PBS洗涤并与JC-1（20 μM）在37°C孵育45分钟。孵育后，用PBS洗涤细胞两次，并用20 μM羰基氰化物3-氯苯腙（CCCP；Sigma）或25 μM H₂O₂在37°C处理1小时。NAC处理采用与LCD相同的方法。CCCP用作阳性对照。使用酶标仪量化荧光。红色荧光强度（指示JC-1聚集体）在550/600 nm（Ex/Em）检测，绿色荧光强度（指示JC-1单体）在485/535 nm检测。使用Operetta CLS高内涵成像系统在20倍放大下获取荧光图像，荧光通道对应Alexa 594（红色）和EGFP（绿色）。

使用ATP测定试剂盒（ab83355；Abcam）测量细胞内ATP水平，该试剂盒采用荧光酶反应通过甘油磷酸化定量ATP。对于试剂制备，将Converter Mix B和Developer Mix N各溶解在220 μL Buffer 23中并保持在冰上。从10 mM储备液新鲜制备0.1 mM ATP标准品，并在Buffer 23中连续稀释（0–10 μL），每孔最终体积为50 μL。收获细胞，用冷PBS洗涤，在100 μL Buffer 23中通过移液裂解，并在4°C以13,000 × g离心5分钟；上清液用于分析。对于每孔，将1–50 μL细胞提取物用Buffer 23调整至50 μL，然后加入50 μL ATP反应混合物。包括缺少Converter Mix B的对照反应以评估背景。在室温黑暗中孵育30分钟后，在535/587 nm测量荧光。

细胞以4 × 10⁶细胞/mL接种在100 mm细胞培养板中。24小时后，去除培养基并更换为含有RA的分化培养基。细胞用不同浓度的LCD（高达2 μM）预处理，然后暴露于H₂O₂（25 μM）。使用Monarch Total RNA Miniprep Kit根据制造商的说明提取总RNA。随后，使用iScript cDNA Synthesis Kit将1,000 ng RNA反转录为cDNA。然后使用StepOnePlus实时PCR系统与GoTaq qPCR Master Mix分析cDNA样品。在60°C测量基因表达。基因列于表1。为了评估神经元分化和发育、神经突生长以及结构和功能可塑性，我们选择了四个公认的神经元标志物：βIII-微管蛋白（TUBB3）、巢蛋白（NES）、GAP43和MAP2。使用比较CT方法（2^?ΔΔCT）实时定量基因表达，并归一化为内参基因β-肌动蛋白的表达。

使用高内涵分析评估神经突生长。细胞在4%甲醛/PBS中固定10–15分钟，然后用PBS洗涤三次。使用含有0.1% Triton X-100的PBS在室温下透化15分钟。为了防止非特异性结合，细胞在含有10% FBS和0.1%牛血清白蛋白的PBS中封闭1小时。然后它们与一抗抗βIII-微管蛋白在含有0.1% Tween-20的PBS中稀释并在4°C孵育过夜。用含有0.1% Tween-20的PBS洗涤后，细胞与Alexa Fluor 488缀合的二抗和0.5 μg/mL DAPI在含有0.1% Tween-20的PBS中孵育1小时。使用Operetta CLS高内涵成像系统与×20共聚焦物镜测量荧光强度。使用Harmony 6.1分析图像，该软件提供用于评估神经突生长的各种模块。

使用补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液裂解细胞。使用BCA测定确定蛋白质浓度。对于分析，每泳道20–40 μg蛋白质在8%、12%或15% SDS-PAGE凝胶上进行电泳，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜在含有1% Tween 20的PBS中用3%脱脂牛奶在室温下封闭1–2小时，然后在4°C与靶向Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-7、GAPDH、PARP-1、p38或p-p38的一抗孵育过夜，所有稀释1:1000。用含有1% Tween-20的PBS洗涤后，膜与HRP缀合的二抗（山羊抗兔IgG-HRP或山羊抗小鼠IgG-HRP）在室温下处理2小时。使用WesternBright ECL底物进行检测。使用ChemiDoc XRS+成像系统捕获图像。

结果表示为平均值±标准误差（SEM），来自三个或更多独立实验。使用SPSS 12 for Windows进行分析。使用单因素ANOVA评估统计显著性，然后进行Dunnett事后检验。差异在p < 0.05时被认为显著。

3 Results

3.1 LCD protects SH-SY5Y cells against H₂O₂-induced cytotoxicity

使用CCK-8和LDH测定测量和评估SH-SY5Y细胞生长和增殖以及LCD细胞毒性。LCD不改变细胞活力。细胞在含有RA的分化培养基中分化5天，并用H₂O₂和LCD处理24小时以测量细胞活力和细胞毒性。H₂O₂以浓度依赖性方式显著降低细胞活力，相对于对照。H₂O₂抑制细胞生长，24小时IC₅₀值为24.47 μM。因此，在后续实验中，使用25 μM H₂O₂可靠诱导神经毒性。LCD IC₅₀为49.29 μM。随后，使用无细胞毒性的低浓度LCD（0.5–2 μM）。在H₂O₂处理组中，0.5、1或2 μM LCD预处理以浓度依赖性方式增加细胞活力。用H₂O₂处理的细胞表现出显著升高的LDH活性，裂解缓冲液处理的阳性对照也是如此。在H₂O₂处理组中，LCD预处理以浓度依赖性方式逆转LDH活性。H₂O₂处理显著降低细胞密度，相对于对照和单独LCD处理，而LCD预处理逆转了H₂O₂诱导的细胞密度减少。

3.2 LCD exhibits neuroprotective effects against H₂O₂-induced neurotoxicity

为了评估LCD的神经保护作用，使用高内涵筛选设备测量神经突生长。在非细胞毒性H₂O₂浓度（15 μM）下，细胞计数没有显著减少，但神经突生长长度减少了>50%。LCD和H₂O₂共处理组在细胞计数和神经突生长长度方面表现出与对照相似的结果。25 μM H₂O₂减少了细胞计数和神经突生长长度，类似于其对细胞活力的影响。在LCD和H₂O₂共处理下，细胞计数和神经突生长长度随着LCD浓度的增加而增加。

我们研究了四个与神经分化、发育和神经突生长直接相关的基因（βIII-微管蛋白、GAP43、巢蛋白和MAP2）。H₂O₂处理降低了它们的表达，βIII-微管蛋白和GAP43表达下降>50%。相反，在LCD处理中，这些基因的表达与未处理对照相似。在LCD和H₂O₂共处理下，四个基因的表达随着LCD浓度的增加而增加。在用H₂O₂和2 μM LCD共处理后，βIII-微管蛋白和GAP43表达与未处理对照相似，而NES和MAP2表达相对于未处理对照分别升高2.23倍和1.58倍。

3.3 NAC mitigates H₂O₂-induced ROS production and neurotoxicity in SH-SY5Y cells

为了评估H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞毒性和神经毒性是否由于ROS产生，我们评估了有和没有抗氧化剂NAC的细胞活力和神经突生长。当用NAC处理时，结果与未处理对照相当，而单独H₂O₂处理将细胞活力降低至<50%。NAC和H₂O₂共处理导致比单独H₂O₂处理更高的细胞活力。细胞毒性在未处理对照、仅NAC处理和LCD + H₂O₂共处理中最小。相反，单独H₂O₂引起高细胞毒性，与阳性对照（裂解缓冲液）相当。单独LCD处理对细胞内ROS产生没有影响。相反，单独H₂O₂处理后细胞内ROS积累显著高于阳性TBHP对照。LCD和NAC共处理在CCK-8测定确认在单一和联合处理中无细胞毒性的浓度下实现神经保护和ROS减少效果。这种共处理没有产生与单独给药时显著不同的协同效应。然而，全面的剂量反应研究和正式协同作用评估方法的应用对于严格评估LCD和NAC共处理的潜在加性或协同相互作用至关重要。

氧化应激诱导的线粒体功能障碍是神经退行性疾病的重要因素。我们进行JC-1分析以检查H₂O₂和LCD对线粒体的影响。单独LCD或NAC均未显著改变线粒体膜电位。然而，用H₂O₂处理后，红绿荧光比率降低，而H₂O₂和LCD共处理以LCD浓度依赖性方式增加该比率；在H₂O₂和NAC共处理下观察到类似增加。用于评估线粒体功能变化对ATP水平影响的ATP产生分析显示，LCD和NAC显著恢复了H₂O₂减少的ATP水平。这些结果表明，LCD减少H₂O₂诱导的细胞内ROS产生并恢复SH-SY5Y细胞中的线粒体功能。在H₂O₂共处理下，LCD以浓度依赖性方式减少ROS产生。NAC类似地减少ROS产生。神经突生长长度在NAC处理下为99.22%，在15 μM H₂O₂处理下为76.60%，在NAC（2 mM）和H₂O₂（15 μM）共处理下为96.48%，相对于未处理对照中的神经突生长长度。类似地，在25 μM H₂O₂处理下为38.61%，在NAC（2 mM）和H₂O₂（25 μM）共处理下为91.04%。细胞计数在用NAC、15 μM H₂O₂或NAC（2 mM）与15 μM或25 μM H₂O₂共处理后没有显著减少。然而，单独25 μM H₂O₂处理显著减少细胞计数。

3.4 LCD inhibits H₂O₂-induced apoptosis

为了评估LCD的潜在作用机制，我们通过Western blotting定量了H₂O₂诱导的凋亡相关蛋白的表达。H₂O₂增加p-p38表达，而LCD预处理减少它。H₂O₂增加促凋亡蛋白Bax的表达并减少抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。然而，这些效应在LCD和H₂O₂共处理下被逆转：Bax表达减少而Bcl-2表达增加。单独H₂O₂减少pro-caspase 3表达，而与LCD共处理挽救了它。这些结果表明LCD有效抑制H₂O₂诱导的凋亡。

4 Discussion

使用SH-SY5Y细胞，我们检查了LCD的神经保护作用及其在减轻H₂O₂诱导的氧化应激中的潜在作用机制。LCD暴露24小时未在SH-SY5Y细胞中诱导显著细胞毒性。这与先前的发现一致，即浓度≤22.6 μM的LCD未显著降低人骨髓间充质干细胞的活力。相反，H₂O₂暴露引起浓度依赖性细胞毒性，在25 μM H₂O₂下将细胞活力降低至<50%。根据我们的发现，LCD逆转了H₂O₂诱导的细胞活力减少。

发育中的神经系统对各种化学物质的影响高度敏感。神经细胞瘤细胞系已在体外用于确认发育神经毒性，因为它们丰富、易于培养并呈现同质群体。通过添加生长因子或撤血清，神经细胞系可分化为具有明显神经特征的细胞。因此，我们用RA处理SH-SY5Y细胞系以诱导分化为神经元细胞系。神经突生长是神经发育的标志，是用于评估发育神经毒性的关键因素。使用这种分化的SH-SY5Y细胞系，我们确认了LCD的神经保护作用。H₂O₂在非细胞毒性浓度下引起发育神经毒性（DNT），LCD预处理减轻了这种DNT相关细胞毒性。类似地，LCD减轻了H₂O₂细胞毒性。这表明LCD可能有效减轻氧化应激诱导的DNT。

观察到的神经突长度减少表明神经发育抑制和相关基因表达改变。βIII-微管蛋白在所有神经元中组成型表达，在神经元结构和功能中发挥重要作用。巢蛋白参与组织神经元细胞骨架，并用作神经上皮干细胞标志物。MAP2是一种广泛使用的神经标志物，通过与微管和F-肌动蛋白相互作用，在神经元形态发生过程（如神经元起始）中发挥重要作用。GAP43在轴突伸长、突触发生和神经元发芽中发挥重要作用，在帕金森病患者大脑中下调。我们的发现揭示，H₂O₂暴露通过细胞骨架调节、神经发育和成熟相关途径诱导发育神经毒性，如βIII-微管蛋白、巢蛋白、MAP2、GAP43表达减少所示。因此，为了推进LCD的临床应用，阐明增加神经突生长标志物水平是否改善突触形成和神经可塑性，从而恢复电生理功能将很重要。此处使用的LCD浓度在先前体外神经元细胞研究报告的有效范围内。然而，基于动物研究的数据，大脑中实际达到的LCD浓度可能较低。因此，增加血脑屏障（BBB）通透性和改善药代动力学特性对于LCD的临床应用至关重要。可以考虑使用各种递送载体和物理方法（如纳米颗粒载体和靶向配体）增强BBB通透性的策略。然而，LCD的物理化学特性，包括低分子量、高脂溶性和低极性，有利于BBB渗透。因此，如果其局限性得到解决，LCD可能作为中枢神经系统疾病治疗剂具有巨大潜力。此外，这些发现提供证据表明LCD通过挽救H₂O₂诱导的基因表达抑制来防止发育神经毒性。然而，由于像LCD这样的多酚化合物可能由于其混杂性导致脱靶效应，未来使用siRNA或选择性抑制剂的研究可能需要验证靶向途径。

H₂O₂处理诱导过量ROS产生。为了确定LCD在减轻SH-SY5Y细胞中H₂O₂诱导的氧化应激的有效性，我们将其效果与常用抗氧化剂NAC的效果进行了比较。NAC预处理挽救了H₂O₂诱导的细胞活力减少并减少了H₂O₂诱导的LDH释放，实现了与LCD预处理相似的效果。NAC和LCD预处理都挽救了H₂O₂诱导的过量ROS产生，表现出相似的有效性。我们使用NAC作为对照来研究LCD如何通过减弱氧化应激实现其神经保护作用。LCD的功效可以通过进一步研究全面验证，包括使用FDA批准的神经保护剂作为比较剂的研究。高细胞内ROS水平可能损伤细胞器如线粒体。这里，H₂O₂诱导线粒体去极化，被LCD或NAC逆转，LCD略比NAC更有效。增加的细胞内ROS产生与癌症和糖尿病等病理以及中风和神经退行性疾病（如帕金森病和阿尔茨海默病）的发展有关。我们的发现证实了NAC对抗ROS诱导的神经毒性的有效性；NAC预处理有效挽救了非毒性H₂O₂浓度下神经突生长的减少，在毒性浓度下结果相似。这与LCD预处理的发现一致，从而确认LCD像NAC一样通过减少ROS产生来抑制神经毒性。这些结果表明LCD可能保护神经元免受氧化应激诱导的线粒体功能障碍和神经毒性。此外，全面的剂量反应研究和正式协同作用评估方法的应用对于严格评估LCD和NAC共处理的潜在加性或协同相互作用至关重要。这仍然是未来药理学评估的开放问题。

像H₂O₂这样的大分子可以产生过量ROS，这可能通过坏死和凋亡等过程导致细胞死亡。在帕金森病模型中，氧化应激激活p38 MAPK通路，最终导致凋亡。这里，H₂O₂处理诱导p38磷酸化，LCD减少它。Bcl-2蛋白家族通过介导促凋亡和抗凋亡蛋白之间的直接结合来调节细胞死亡。抗凋亡蛋白（守护者），包括A1、Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W和Mcl-1，通过抑制BAX和BAK（下游促凋亡蛋白（效应子））的线粒体外膜渗透来促进细胞存活。这里，H₂O₂促进Bax表达并减少Bcl-2表达，LCD逆转这些效应。大多数凋亡通路导致caspase激活，凋亡caspase包括上游起始子和下游效应子。这里，LCD有效抑制H₂O₂诱导的cleaved caspase-3表达。H₂O₂诱导的氧化应激激活p38 MAPK凋亡相关通路，LCD逆转这种激活。LCD的氧化应激减少和细胞活力增强效应与患者来源的诱导多能干细胞报告的发现一致，支持LCD的神经保护潜力和临床适用性。在SH-SY5Y细胞中，LCD显著减少H₂O₂诱导的p38 MAPK通路相关凋亡、ROS积累、线粒体膜电位损失和神经毒性。这些抗氧化和凋亡效应可能与抑制ROS诱导的MAPK激