靶向测序技术革新骨关节感染诊断：单中心研究揭示tNGS在原发性骨关节感染中的精准诊断价值

　　本刊推荐：本研究系统评估靶向二代测序（tNGS）技术在原发性骨关节感染（POI）诊断中的价值，证实其灵敏度（85.0% vs 31.0%）和ROC曲线下面积（AUC=0.926）显著优于传统方法，可同步检测病原体及耐药基因（如rpoB S450L突变），为POI的精准抗感染治疗提供重要分子依据。

　　

1 引言

骨关节感染作为具有显著临床挑战性的感染性疾病类型，其诊断始终面临巨大困难。原发性骨关节感染（Primary Osteoarticular Infection, POI）特指原发于骨关节系统的感染性疾病，可累及四肢、脊柱等多个部位。流行病学研究显示，仅脊柱感染在欧洲和美国的年发病率已达6.5/10万，且呈持续上升趋势。该病主要通过血行传播，但约30%病例感染来源不明。从病原学角度看，细菌感染占主导地位（85%-90%），其中化脓性细菌（如金黄色葡萄球菌、链球菌属）约占65%，肉芽肿性感染（如结核分枝杆菌、布鲁氏菌属）占20%-25%，真菌感染虽不足5%但常因生物学特性导致误诊和灾难性后果。

POI的临床表现缺乏特异性，主要症状包括持续性局部疼痛（92%）、活动受限（78%）和炎症标志物升高。免疫抑制状态（如糖尿病、HIV感染、实体器官移植等）患者感染扩散风险增加3-5倍。现行诊断指南强调多模式评估体系，结合临床表现、影像学特征（MRI灵敏度达94%）和微生物学证据构建诊断框架。但病原学确认仍面临显著瓶颈：传统细菌培养检测周期长（平均5-7天），且难检测厌氧菌，抗生素暴露患者假阴性率高达40%-60%；血清学检测（如布鲁氏菌凝集试验）虽操作简便，但因交叉反应存在假阳性风险（特异性仅82%-88%）；Xpert MTB/RIF等分子检测虽显著提升骨关节结核诊断效率，但无法同步检测非结核分枝杆菌和耐药谱。

在此背景下，二代测序技术为突破诊断困境提供新路径。宏基因组二代测序（mNGS）通过无偏倚病原体筛查，在脊柱感染病原体鉴定中展现83.6%的灵敏度，较传统培养方法提升27.3%。但mNGS经济成本显著高于培养和组织病理学，限制其临床广泛应用。相比之下，靶向二代测序（targeted next-generation sequencing, tNGS）具有检测时间短、成本相对较低、病原诊断灵敏度高等优势。tNGS通过多重PCR扩增策略，可特异性捕获400余种骨科相关病原体和23类耐药基因，在假体周围感染诊断中检测率达89.2%，平均检测周期缩短至26小时。现有证据表明，tNGS在肺部感染领域已建立成熟临床应用路径，与药敏试验一致性达93.7%，还能直接从临床标本或培养物中可靠预测结核分枝杆菌耐药性，为结核病患者适时治疗提供关键信息。在假体周围感染中，tNGS对病原菌检测优于细菌培养，与mNGS无显著差异，且在耐药基因检测以及成本和时间方面优于细菌培养和mNGS。对于POI，发病机制和耐药基因检测与诊断同等重要，但高质量研究仍匮乏，尤其缺乏针对POI特有病原谱特征的系统评价。

2 材料与方法

2.1 纳入与排除标准

纳入标准：根据临床症状、体征、实验室检查和影像学检查诊断为原发性骨关节感染的患者；通过手术或超声引导穿刺获取足够组织样本进行tNGS检测；接受过相关病原学检查（细菌培养、X-pert、布鲁氏菌凝集试验和病理检查）的患者。

排除标准：确诊但未接受相关治疗的患者；随访时间不足1个月；患有严重免疫系统疾病（如晚期癌症、HIV/AIDS等）；临床资料不完整的患者。

2.2 一般临床资料

根据纳入排除标准，共纳入2023年9月至2024年9月宁夏医科大学总医院骨感染病房诊断的87例POI患者，平均年龄55.36±17.24岁，男女比例1.35:1，包括骨关节结核（35例）、布鲁氏菌性骨关节炎（21例）和化脓性骨关节感染（31例）。收集患者年龄、性别、基础疾病、临床症状、实验室检查和影像学结果等数据。手术患者术中获取组织样本，非手术治疗者经皮穿刺获取。每份样本分三部分：第一部分置于无菌运输容器进行病原培养和X-pert检测；第二部分储存于无菌运输容器进行tNGS检测；第三部分用福尔马林固定进行组织病理学分析。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

2.2.1 细菌培养

组织标本研磨成匀浆后接种于血琼脂、巧克力和麦康凯平板进行细菌培养，沙堡弱琼脂进行真菌培养。关节液标本直接注入需氧和厌氧血培养瓶进行检测培养。

2.3 Xpert检测

通过手术或穿刺采集患者病变组织样本，与试剂盒缓冲液混合进行初步处理，将处理后的样本置于Xpert设备中，采用PCR技术进行扩增，实时监测反应并分析结果。

2.4 布鲁氏菌凝集试验（SAT）

采集待检者血清样本（通常为静脉血），按一定比例（通常1:10、1:20等）与稀释液混合，室温孵育一定时间（如30分钟），加入制备的布鲁氏菌抗原轻混后，在适当温度（通常37°C）孵育一定时间（如2小时或过夜），观察试管底部凝集情况。

2.5 病理检查

通过手术切除、活检等方式获取组织标本，立即用10%福尔马林溶液固定以保存细胞形态结构，经不同浓度乙醇脱水后石蜡包埋，用切片机切成4-5微米薄片，采用HE染色（苏木精-伊红染色）和免疫组化染色等方法染色，显微镜下观察细胞形态、排列和组织结构进行诊断。

2.6 靶向二代测序

使用Agilent 2100 Bioanalyzer和Qubit dsDNA HS Assay Kit对文库片段大小和浓度进行质控。采用上海弼因医疗开发的GenSeizer靶向捕获和文库构建技术，首先使用大量针对目标基因的引物对测试样本中的核酸进行超多重PCR扩增，实现基因扩增产物的靶向富集，然后通过一轮PCR向不同样本的扩增产物添加特异性测序接头和标签完成文库构建。DNB文库通过滚环复制扩增变性为单链环状DNA生成DNB纳米球，加载到测序芯片后使用MiniSeqDx-CN测序平台（广州金域瑞测序平台）进行测序。

使用Burrows-Wheeler Alignment（BWA）从测序数据中去除低质量和短读长序列（长度<35bp），将剩余读长序列与病原特异性微生物数据库比对（包含4000余种临床常见病原微生物，包括细菌、真菌、寄生虫、DNA病毒、RNA病毒等，以及重要细菌耐药基因和毒力基因），通过比对算法获得匹配各种病原特异性序列的读长计数，根据序列数量和其他临床检测确定潜在病原体。

2.7 统计分析

使用SPSS 26.0进行数据分析。分类变量以百分比表示，连续变量以均值±标准差表示。计算灵敏度、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）及95%置信区间。采用Shapiro-Wilk检验评估连续变量正态性，组间比较采用卡方检验，通过Kappa检验评估tNGS与其他检测方法的一致性，采用Delong检验比较不同方法的诊断性能。P<0.05认为有统计学意义。

3 结果

3.1 研究人群特征

本研究共纳入87例POI患者，平均年龄55.36±17.24岁，男性50例（57.5%），女性37例（42.5%）。

按病因分类：结核性骨关节感染35例（40.2%），平均年龄57.20±18.31岁，男性17例（48.6%），女性18例（51.4%）；布鲁氏菌性骨关节感染21例（24.1%），平均年龄57.67±10.54岁，男性14例（66.7%），女性7例（33.3%）；化脓性骨关节感染31例（35.6%），平均年龄51.71±19.40岁，男性19例（61.3%），女性12例（38.7%）。

3.2 病原体检出谱及检测一致性

3.2.1 病原体检出谱

tNGS和培养检测的微生物结果显示，结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex）是tNGS检测的最常见微生物（33例），其次为布鲁氏菌（21例）。细菌是POI最常见的病原体，其次为病毒和真菌。

3.2.2 tNGS与培养一致性

在21例tNGS和培养双阳性样本中，15例（71.4%）完全匹配，2例（9.5%）部分匹配，4例（19.0%）不匹配。排除MTBC后，两种方法总体一致性中等（Cohen’s κ=0.536, P<0.001）。

MTBC检测局限性：由于结核分枝杆菌培养需要BSL-3实验室支持，本院MTBC培养技术有限，对临床疑似结核患者采用Xpert MTB/RIF补充检测，确认29例（82.9%, 29/35），与tNGS结果高度一致（κ=0.812, P<0.001）。

3.3 结核性骨关节感染的诊断效能

在35例结核性骨关节感染患者中：

灵敏度：tNGS（91.43%, 32/35）显著高于Xpert（82.86%, 29/35; χ2=6.12, P=0.013）和病理检查（62.9%, 22/35; χ2=9.84, P=0.002）；

特异性：tNGS和Xpert均为96.2%（50/52），病理检查达100%（52/52）（P>0.05）；

诊断准确性：ROC分析显示tNGS（AUC=0.938, 95%CI: 0.891-0.985）优于Xpert（AUC=0.895, 95%CI: 0.827-0.963）和病理检查（AUC=0.819, 95%CI: 0.733-0.905）（Delong检验, P<0.05）；

一致性分析：tNGS与Xpert高度一致（Cohen’s κ=0.877, P<0.001），与病理检查中度一致（κ=0.694, P<0.001）；

耐药基因检测：tNGS检测到6例耐药（异烟肼2例、利福平2例、乙胺丁醇1例、链霉素1例），1例多重耐药（异烟肼+利福平+乙胺丁醇+链霉素+喹诺酮类）。

3.4 布鲁氏菌性骨关节感染的诊断效能

在21例布鲁氏菌感染患者中：

灵敏度：tNGS（100%, 21/21）显著高于SAT（90.5%, 19/21）、细菌培养（33.3%, 7/21）和病理检查（9.5%, 2/21）（P<0.001）；

特异性：tNGS、细菌培养和病理检查均为100%（66/66），SAT为98.5%（65/66）（P>0.05）；

诊断准确性：tNGS（AUC=1.000）和SAT（AUC=0.969, 95%CI: 0.934-1.000）显著优于细菌培养（AUC=0.667）和病理检查（AUC=0.548）；

一致性分析：tNGS与SAT几乎完全一致（κ=0.937, P<0.001），与细菌培养中度一致（κ=0.431, P=0.002），与病理检查一致性低（κ=0.138, P=0.112）。

3.5 化脓性骨关节感染的诊断效能

在31例化脓性感染患者中：

灵敏度：tNGS（71.0%, 22/31）高于细菌培养（48.4%, 15/31），但差异无统计学意义（χ2=2.85, P=0.091）；

特异性：tNGS（98.2%, 55/56）与细菌培养（92.9%, 52/56）无显著差异（χ2=1.07, P=0.301）；

诊断准确性：tNGS（AUC=0.846, 95%CI: 0.754-0.938）显著优于细菌培养（AUC=0.706, 95%CI: 0.583-0.829）（P=0.032）；

一致性分析：tNGS与细菌培养高度一致（κ=0.624, P<0.001）；

耐药基因检测：tNGS检测到1例携带超广谱β-内酰胺酶基因（bla_CTX-M-15型）。

3.6 综合诊断效能

tNGS在三种类型骨关节感染中均显示显著优势：

灵敏度梯度：布鲁氏菌感染（100%）>结核性骨关节感染（91.43%）>化脓性感染（71.0%）；

诊断准确性：布鲁氏菌感染（AUC=1.000）>结核性骨关节感染（AUC=0.938）>化脓性感染（AUC=0.846）；

附加价值：同步检测到7个耐药相关基因（包括6例MTB耐药和1例ESBLs基因），覆盖一线抗结核药物和β-内酰胺类抗生素；

时间成本：本研究培养结果平均获取时间7.27天，tNGS检测结果平均仅需2.62天，与相关研究一致。

与传统方法（细菌培养、SAT和病理检查）相比，tNGS在灵敏度（平均87.8% vs 42.3%）、AUC值（平均0.928 vs 0.712）和时间成本方面均显示统计和临床显著改善。

4 讨论

骨关节感染在骨科临床中破坏性大且治疗困难，存在标本获取难、患者常接受药物治疗进一步降低细菌检出率等问题，准确诊断困难。延迟诊断可导致神经症状等严重后果如截瘫、截肢，以及慢性化导致住院时间延长甚至多次手术。对骨关节感染而言，准确快速的病原学诊断对制定合适抗生素方案至关重要，可缩短感染病程甚至提高治愈率。当前诊断依赖临床表现、实验室和影像学检查以及病原检测，但临床相关诊断技术 alone 不能提供明确诊断，病原检测不可或缺。现有病原检测如细菌培养检出率低、检测周期长，无法满足骨关节感染快速诊断需求，这对临床医生无疑是巨大挑战。

近年来二代测序（NGS）技术的发展显著提高了骨关节感染病原菌检出率，特别是宏基因二代测序技术。相关文献报道mNGS可用于鉴定脊柱感染病原体，对指导用药具有重要意义，且相比细菌培养在诊断过程中对灵敏度和特异性具有显著优势。但当前mNGS成本远高于细菌培养和组织病理学，限制其临床广泛应用。相关文献报道tNGS对相关感染性疾病的病原体及耐药检测具有价值，且相关成本远低于mNGS。因此探索tNGS在骨关节感染中的诊断价值十分必要。但关于tNGS在POI中价值的文献较少。除mNGS和tNGS外，16S rDNA广谱PCR也已广泛应用，尤其在培养阴性感染中。该方法提供快速灵敏的诊断途径，对检测常规技术可能漏检的生长缓慢或难培养病原体特别有用。近期研究表明16S PCR不应被认为优于mNGS而是互补：它提供快速经济的细菌检测，而mNGS以更高成本提供更广病原覆盖。尽管本研究因探索性设计和资源限制未进行16S PCR，但我们认识到其潜在临床价值，并在讨论中强调其作为重要补充工具的意义。

骨关节结核感染的诊断和治疗也相对复杂，临床诊断结核分枝杆菌病原体的方法较多，如：特定分枝杆菌培养基培养、X-pert等方案，但均存在或多或少缺陷。有学者使用tNGS技术对43份痰标本进行结核分枝杆菌测序，结论认为痰测序有望比痰培养提供更全面快速的耐药检测。相关文献报道在儿童TB患者中，tNGS诊断儿童结核比X-pert具有更高灵敏度但较低特异性。对胃液和痰标本，tNGS比X-pert更敏感。感染结核分枝杆菌复合群（MTBC）的骨关节结核患者需要抗生素联合治疗，但常规抗结核方案对多重和广泛耐药MTBC无效。MTBC药敏试验需数周至数月完成，而tNGS可快速高效检测耐药基因，是在临床或诊断实验室环境中直接从原始标本检测耐药TB的灵敏、可靠且经济有效的方法，对耐药TB治疗有良好指导作用。除检测结核分枝杆菌复合群耐药突变外，本研究还证明tNGS可揭示与骨关节和假体周围感染相关的其他病原体的耐药决定因素。例如，在革兰阴性菌分离株中鉴定出超广谱β-内酰胺酶（ESBL）基因如bla_CTX-M-15。这些发现具有临床意义，使医生能够优化抗生素方案：当不存在耐药时缩窄广谱经验性治疗，或当存在耐药基因时升级至特定抗ESBL方案。因此tNGS不仅促进快速病原鉴定，还有助于更广谱感染的抗菌策略优化。然而我们注意到表型药敏确认在本队列中未能一致获得，强调这是未来前瞻性研究应解决的局限性。

布鲁氏菌病是常见人畜共患病，每年影响50万人。神经系统受累占4-7%。该病常侵犯脊柱，2-30%发病率涉及骨骼。其诊断主要基于细菌培养，但假阴性结果较多。目前不同物种布鲁氏菌凝集试验是主要诊断手段。有文献报道布鲁氏菌凝集试验对布鲁氏菌病诊断具有高灵敏度和特异性。核酸扩增试验是对该病快速诊断的高灵敏度、高特异性和安全检测方法。据报告已完全康复的患者可能长期持续阳性分子检测结果。研究表明脑脊液（CSF）下一代测序（NGS）在神经布鲁氏菌病诊断中表现出强大能力，实现病原体快速准确检测。全基因组测序技术在所有分离株中鉴定出mprF、bepG、bepF、bepC、bepE和bepD，但未能鉴定其他经典耐药基因。对于tNGS病原诊断布鲁氏菌病，文献尚无报道。相比之下，本研究比较了tNGS与布鲁氏菌凝集试验以及细菌培养和病理学，证明tNGS在诊断布鲁氏菌骨关节感染中具有更高诊断效能，但与布鲁氏菌凝集试验无显著差异。

除结核和布鲁氏菌病外，本研究证明tNGS检测到多种化脓性细菌，包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和链球菌属等，同时鉴定出如bla_CTX-M-15等耐药基因。这些发现表明tNGS为非结核性骨关节和假体周围感染的个体化治疗提供宝贵指导。既往研究也报道tNGS可有效鉴定假体周围感染病原体，灵敏度和特异性高于细菌培养，与宏基因二代测序无显著差异，但相比mNGS具有低成本和快速周转时间优势，且能提供患者耐药信息，综合而言tNGS具有高诊断价值。本研究评估了tNGS在非结核分枝杆菌复合群和非布鲁氏菌属感染的骨关节感染中的有效性，文献罕有报道。本研究中tNGS在诊断灵敏度、特异性以及ROC曲线AUC值方面优于细菌培养，但因条件限制未进行mNGS对比诊断。已知尽管mNGS具有高灵敏度和特异性，但存在高成本等缺点，对患者负担较重。

靶向二代测序技术不仅在感染性疾病，特别是病原微生物鉴定方面成效显著，还对癌症诊治、遗传性疾病诊断、品种鉴定和基因组选择等贡献巨大。tNGS可能持续改变现有科研和临床应用模式，为临床医学检测和传染病防控做出重要贡献。

本研究仍存在一些局限性。首先，本研究为单中心研究，样本采集前部分临床信息可能不完善；其次，因就诊本病房患者多为骨关节感染确诊者，导致未纳入非骨关节感染患者，可能一定程度偏倚结果，影响结论精确性和可靠性。未来需要持续大样本多中心研究提高发现可靠性。

5 结论

本研究通过多维度检测方法对比，证实tNGS技术凭借高效、广覆盖和准确性优势，可同步实现POI病原体鉴定和耐药基因检测，在临床诊断中展现显著优势。该技术对优化抗感染治疗方案具有重要指导价值，推荐作为POI一线分子诊断工具广泛推广。