临床诺卡菌耐药性的基因组学与表型特征研究：中国148株临床分离株的分析

　　本研究通过对中国13个省份148株临床诺卡菌分离株进行全基因组测序(WGS)和药敏试验(AST)，系统揭示了诺卡菌属的耐药表型与基因型关联。研究发现14个潜在新种，鉴定出物种特异性耐药模式：N. farcinica对头孢菌素和妥布霉素耐药，N. otitidiscaviarum对β-内酰胺类和喹诺酮类广泛耐药，N. cyriacigeorgica对喹诺酮类、头孢吡肟和头孢西丁耐药。首次报道blaAST-1介导的泛β-内酰胺耐药机制。38.51%菌株呈现多重耐药(MDR)，强调基因组监测对临床精准治疗的重要性。

　　

1 引言

诺卡菌作为放线菌目成员，主要感染免疫功能低下个体，如HIV感染者、器官移植受体或慢性肺病患者，但也可在免疫正常个体中引起感染。若原发部位感染未得到及时有效治疗，可能播散至全身，引发严重感染甚至死亡。近年来随着老年人群、免疫缺陷患者、器官移植受体和HIV感染者数量增加，诺卡菌感染发病率逐渐上升。研究表明诺卡菌菌血症患者死亡率约50%，而播散性感染患者死亡率高达44%-85%。作为危及生命的感染，诺卡菌感染带来重大临床挑战。

鉴于诺卡菌属内巨大的多样性，临床实验室通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定罕见物种仍存在困难。此外，不同诺卡菌物种的药敏模式差异可能导致治疗失败。准确物种鉴定对于理解诺卡菌流行病学和致病性至关重要。

全球抗菌耐药性(AMR)上升构成重大公共卫生威胁。虽然大多数诺卡菌菌株仍对阿米卡星、利奈唑胺和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑敏感，但对β-内酰胺抗生素、喹诺酮类、氨基糖苷类和其他抗生素的敏感性存在差异。

中国各地区关于诺卡菌种抗生素敏感性的报告已有发表，但这些报告仅限于耐药表型方面，未探索耐药的遗传基础。

全基因组测序(WGS)作为一种高通量测序技术，为检测临床细菌菌株中的AMR基因提供了全面方法。此外，WGS有助于预测细菌遗传谱和功能表型。因此，该技术的应用显著提高了临床微生物检测效率，为诺卡菌物种鉴定和指导治疗干预提供了关键信息。

理解诺卡菌分离株的遗传多样性及其耐药机制对于指导经验性抗生素治疗至关重要。本研究旨在对从中国13个省份收集的148株临床诺卡菌分离株进行抗菌敏感性测试和WGS，评估其耐药表型、AMR基因和遗传特征。这些发现将加深我们对驱动诺卡菌耐药的遗传因素以及遗传背景与耐药性之间关系的理解，为更有效的诺卡菌病临床管理提供有价值的信息。

2 材料与方法

2.1 菌株收集与初步鉴定

本研究中的诺卡菌菌株从中国13个省级行政区划的临床标本中分离，包括省、自治区和直辖市。菌株纯化后，在脑心浸液(BHI)血琼脂上培养至少48小时。使用甲酸/乙醇提取法，通过MALDI-TOF MS对新鲜挑取的菌落进行分析。

2.2 抗生素敏感性试验

使用Sensititre RAPMYCO微量稀释板测定最小抑菌浓度(MIC)，结果使用R包ggplot2可视化。使用R Studio软件计算MIC₅₀和MIC₉₀。AST板包括15种抗生素：阿米卡星、阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟、头孢西丁、头孢曲松、环丙沙星、克拉霉素、多西环素、亚胺培南、利奈唑胺、米诺环素、莫西沙星、替加环素、妥布霉素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑。使用金黄色葡萄球菌ATCC 29213和大肠杆菌ATCC 25922作为参考菌株进行质量控制。结果根据临床和实验室标准协会(CLSI)标准M24-A2中指定的诺卡菌解释标准进行判读。由于磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的MIC定义为抑制80%生长的最低浓度，使用MIC测试条(MTS)方法进行额外验证以确保AST结果的准确性。

2.3 DNA提取与WGS

菌株在BHI液体培养基中连续传代两次。通过离心收集细菌细胞形成沉淀。使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒从沉淀中提取基因组DNA。提取后，使用NanoDrop仪器测量DNA纯度和浓度。然后使用Illumina Novaseq平台在PE150模式下对DNA样本进行测序，确保所有测序深度超过100倍。使用Fastp检查和质量修剪读取。使用SPAdes进行从头组装，使用Prokka注释草图基因组。使用Quast和CheckM估计基因组大小、编码序列(CDSs)数量和GC含量。

2.4 系统发育树构建和平均核苷酸同一性分析

为了更全面地了解诺卡菌菌株的分类和遗传进化，从国家生物技术信息中心(NCBI)下载了70株人源诺卡菌菌株的全基因组序列。使用Roary进行泛基因组和核心基因组分析。通过BLASTn识别单拷贝核心基因。然后使用FastTree基于核心基因组构建系统发育树，并通过iTOL可视化。通过Pyani计算所有基因组之间的成对ANI值，并通过R包pheatmap可视化。通过基因组到基因组距离计算器2.1(GGDC)使用"公式2"计算计算机DNA-DNA杂交(isDDH)值。

2.5 抗生素耐药基因分析

使用Rgi以60%同一性和70%覆盖度的截止值对抗综合抗生素耐药数据库(CARD)鉴定ARGs。使用R包pheatmap可视化AGR。使用BLASTn分析基因存在/缺失，通过Clustal Omega进行序列比对分析基因突变。使用Cramér's V统计量评估表型耐药与耐药基因之间的关联，该统计量衡量两个分类变量之间的关联，范围从0(无关联)到1(完美关联)。结果可视化为热图，其中每个单元格包含Cramér's V值及其统计显著性。颜色强度反映关联强度：黄色调表示弱或无关联(值接近0)，而深紫色调表示强关联(值接近1)。

3 结果

3.1 诺卡菌物种分布

在通过MALDI-TOF MS初步鉴定的148株临床分离株中，表征了10个诺卡菌物种，大多数从呼吸道分离。具体而言，主要物种为N. farcinica(60.8%, 90/148)，其次是N. cyriacigeorgica(16.2%, 24/148)、N. otitidiscaviarum(10.8%, 16/148)和N. wallacei(5.4%, 8/148)。相比之下，较少分离的物种包括N. brasiliensis(2.0%, 3/148)、N. nova(1.4%, 2/148)、N. blacklockiae(1.4%, 2/148)、N. transvalensis(0.7%, 1/148)、N. beijingensis(0.7%, 1/148)和N. aobensis(0.7%, 1/148)。值得注意的是，N. farcinica占所有分离株的一半以上。

3.2 通过ANI验证物种

应用95-96% ANI阈值定义成对基因组之间的物种边界。对218株诺卡菌菌株(本研究148株临床分离株和从NCBI检索的70株临床分离株，包括42个物种)进行成对ANI比较。基于ANI分析，重新分类了四个没有NCBI模式菌株的物种，并重新分类了本研究的四个诺卡菌菌株：两例N. brasiliensis被重新分类为N. cyriacigeorgica；一例N. farcinica被重新分类为N. sputorum；一例N. beijingensis被重新分类为N. sputi。此外，14株分离株可能代表诺卡菌属内分类学上未分类的物种(即新种)。这些菌株最初通过MALDI-TOF MS鉴定为N. cyriacigeorgica(n=4)、N. wallacei(n=6)、N. farcinica(n=1)和N. blacklockiae(n=1)，表现出超过已建立物种阈值的基因组 divergence。此外，N. cyriacigeorgica 105602、CDC381、CDC481、CDC519、CDC528、CDC546和CDC579与N. cyriacigeorgica显示最接近的ANI。然而，它们与其他N. cyriacigeorgica菌株的ANI值低于95%物种划分阈值。因此，这些菌株被鉴定为代表新的/未识别的诺卡菌物种。系统发育分析进一步显示，菌株105602、CDC381和CDC546构成一个 distinct 物种，而菌株CDC481、CDC519、CDC528和CDC579构成另一个。此外，六个未识别的诺卡菌菌株与N. wallacei显示最接近的ANI。然而，由于它们的ANI值低于95%物种划分阈值，它们可能代表与N. wallacei系统发育相关的新物种。MALDI-TOF MS正确鉴定了大多数诺卡菌分离株。除未识别的诺卡菌物种外，该技术对分离菌株的物种水平鉴定准确率达到97.1%(132/136)。这种高准确性为诺卡菌感染的初步临床筛查提供了可靠指导。

3.3 基因组特征和全基因组系统发育分析

148株临床诺卡菌分离株和70株NCBI参考菌株的基因组特征详细列出。主要物种N. farcinica、N. otitidiscaviarum和N. cyriacigeorgica的平均基因组大小分别为6.36 Mb、7.52 Mb和6.44 Mb，平均编码序列(CDSs)分别为5,956、6,892和5,820，平均GC含量分别为70.7%、69.0%和68.3%。

为了进一步评估诺卡菌菌株之间的分类关系，使用来自218株诺卡菌菌株的668个单拷贝基因的全基因组序列构建了圆形全基因组系统发育树。系统发育树涵盖46个物种，显示大多数相同诺卡菌物种的菌株聚集在同一进化枝中。本研究中的148株菌株和来自NCBI的70株菌株均从临床患者中分离。在本研究的12株未识别诺卡菌菌株中，6株与N. cyriacigeorgica表现出密切的系统发育关系，而其余6株聚集在N. wallacei进化枝内，可能代表N. transvalensis复合群内的新物种。

3.4 耐药表型分析

图3展示了本研究中最普遍的三种诺卡菌物种对15种AST的MIC分布，包括MIC₅₀、MIC₉₀和耐药率，其他诺卡菌物种的AST结果可在补充表中找到。使用MTS方法进行磺胺甲噁唑/甲氧苄啶AST结果以确保准确性。所有临床分离的诺卡菌菌株对利奈唑胺表现出100%敏感性，其次是甲氧苄啶/磺胺甲噁唑(140/148, 94.6%)和阿米卡星(138/148, 93.2%)。相比之下，对克拉霉素的敏感性显著较低，为4.7%(7/148)。对于甲氧苄啶/磺胺甲噁唑，超过8/152 mg/L的MIC值仅在N. farcinica中观察到。此外，仅在N. transvalensis复合群中检测到阿米卡星耐药，包括N. wallacei、N. blacklockiae和一些与N. wallacei密切相关的新的/未识别物种。

对于β-内酰胺抗生素，包括亚胺培南、头孢吡肟、头孢西丁、阿莫西林/克拉维酸和头孢曲松，诺卡菌物种对头孢菌素的敏感性较低：头孢吡肟(14.2%)、头孢西丁(8.8%)和头孢曲松(23.0%)。注意到显著的种间抗菌敏感性差异。亚胺培南敏感性在N. farcinica中为89.8%，而在N. cyriacigeorgica和N. otitidiscaviarum中分别为35.0%和0%。类似地，阿莫西林/克拉维酸敏感性变化显著，N. farcinica为85.2%，而N. cyriacigeorgica和N. otitidiscaviarum分别显示20.0%和0%敏感性。此外，N. otitidiscaviarum菌株对所有β-内酰胺抗生素完全耐药，具有相应的高MIC值。

对于四环素类，多西环素和米诺环素表现出高的中介敏感性率，分别为83.1%和87.8%。诺卡菌物种对喹诺酮抗生素环丙沙星和莫西沙星表现出不同的敏感性谱。N. farcinica对环丙沙星和莫西沙星的敏感性率分别为69.3%和84.1%，而N. cyriacigeorgica和N. otitidiscaviarum对环丙沙星完全耐药(100%不敏感)，但对莫西沙星分别显示15.0%和12.5%敏感性。除N. farcinica外，其他诺卡菌物种对替加环素的MIC值较低。妥布霉素敏感性变化显著：N. farcinica表现出完全耐药(100%不敏感)，而N. cyriacigeorgica和N. otitidiscaviarum分别证明90.0%和68.8%敏感性。

在本研究中，我们遵循Schlaberg等人提出的定义，将多重耐药(MDR)诺卡菌定义为对两种或更多最常用经验性抗生素(阿米卡星、头孢曲松、亚胺培南和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑)耐药或中介耐药的分离株。本研究中临床诺卡菌分离株的总体MDR率为38.51%(57/148)，其中N. farcinica为29.55%(26/88)、N. cyriacigeorgica为45%(9/20)、N. otitidiscaviarum为100%(16/16)、N. wallacei为100%(2/2)。

3.5 抗生素耐药基因

基于148株临床诺卡菌分离株WGS的抗生素耐药谱分析通过点图可视化，鉴定出27个ARG，这些ARG涉及至少9类抗菌药物。利福平耐药基因rbpA和四环素耐药基因tetA(58)和tetB(58)在诺卡菌物种中普遍存在。此外，赋予部分β-内酰胺抗生素耐药的β-内酰胺酶基因bla_FAR-1在N. farcinica中占主导地位，而赋予万古霉素耐药的vanRO和vanSO在该物种中缺失。bla_AST-1表现出物种特异性分布，在N. cyriacigeorgica和N. otitidiscaviarum中普遍存在，其在N. otitidiscaviarum中的同源物与泛β-内酰胺耐药相关。林可酰胺抗生素耐药基因lmrC仅在N. cyriacigeorgica中存在，而氨基香豆素抗生素耐药基因novA是N. otitidiscaviarum独有的。引人注目的是，三个携带磺胺耐药基因sul1的N. farcinica菌株表现出升高的磺胺甲噁唑/甲氧苄啶MIC值(>8/152 μg/mL)，而sul1在其他磺胺甲噁唑/甲氧苄啶耐药的诺卡菌物种中缺失。

对于赋予超出ARGs的耐药的基因，我们使用多序列比对分析了warA、aph(2’’)和gyrA。warA赋予对氨基糖苷类抗生素的耐药性，在N. wallacei及其相关物种中检测到，但在阿米卡星耐药的N. blacklockiae中缺失。编码氨基糖苷2''-O-磷酸转移酶并介导妥布霉素耐药的aph(2’’)基因在N. farcinica和N. blacklockiae中广泛检测到，与其妥布霉素耐药表型一致；然而，在其他妥布霉素耐药的诺卡菌物种中缺失。环丙沙星耐药可能由gyrA基因突变引起。在本研究中，我们在gyrA中鉴定了五个氨基酸替换：在N. cyriacigeorgica中的Ser83Ala，在N. otitidiscaviarum和N. terpenica中的Ser83Thr，在N. sputi中的Ser83Val，以及在N. wallacei相关新物种中的Ser83Leu和Ser83Trp。这些突变通常与环丙沙星耐药表型一致。此外，在环丙沙星耐药的N. farcinica中未检测到gyrA突变。

Cramér's V分析确定了表型耐药与耐药基因之间的显著关联。sul1和qacEΔ1与磺胺甲噁唑耐药表型强烈相关(两者V = 0.60, P < 0.001)。类似地，bla_AST-1和bla_FAR-1显示与阿莫西林耐药强烈相关(V = 0.64和0.63，分别；两者P < 0.001)。gyrA突变与环丙沙星耐药表现出强正相关(Cramer's V = 0.77, P <0.001)，而aph(2’’)基因的存在与妥布霉素耐药显著相关(V = 0.67, P <0.001)，warA基因携带证明与阿米卡星耐药最强关联(V = 0.89, P <0.001)。

4 讨论

本研究结合物种鉴定、AST和临床诺卡菌分离株的WGS，系统探索了它们的系统发育结构，表征了抗菌耐药模式，并阐明了耐药决定因素的种间差异基因组特征，对分类学和临床管理都具有意义。

在本研究中，临床诺卡菌分离株主要由三个物种组成：N. farcinica(59.5%, 88/148)、N. cyriacigeorgica(13.5%, 20/148)和N. otitidiscaviarum(10.8%, 16/148)，合计占所有分离株的83.8%。在新西兰和美国的大规模诺卡菌研究中，N. nova、N. cyriacigeorgica、N. farcinica占主导地位，而在中国最大规模的诺卡菌研究中，N. farcinica、N. cyriacigeorgica、N. abscess和N. otitidiscaviarum占主导地位，与本研类似，表明不同物种的流行趋势因地区而异。N. farcinica和N. cyriacigeorgica与该属其他物种相比表现出更高的临床流行率。

质谱法在物种水平鉴定中表现出高准确性，成功鉴定了大多数临床流行的诺卡菌物种。这些发现表明其在临床环境中进行初步诺卡菌筛查具有相当大的潜力。因此，临床分离株的初级质谱分析是疑似诺卡菌病诊断工作流程中的必要步骤。然而，它错误地鉴定了几种遗传上不同的分离株，特别是新分类群，强调了基于质谱的方法对于复杂属的局限性。质谱鉴定基于数据库，需要不断改进和更新以应对大量诺卡菌物种。ANI分析似乎解决了这些模糊性，导致四个分离株的重新分类和14个潜在新物种的发现，主要 within the N. cyriacigeorgica and N. transvalensis lineages。虽然迄今为止已成功命名130种诺卡菌，但本研究表明临床实践中仍有许多未命名的诺卡菌物种。这些发现反映了 clinically relevant 诺卡菌物种的持续多样化，并强调了基于WGS持续分类细化的必要性。本研究建议MALDI-TOF数据库应根据ANI的重新分类进行更新，以更好地解决诺卡菌的物种鉴定问题。

AST揭示了诺卡菌物种中显著