循环肿瘤DNA作为食管鳞癌术后分子残留疾病标志物的研究

　　本研究针对食管鳞癌(ESCC)术后分子残留疾病(MRD)检测难题，通过超灵敏测序技术分析ctDNA动态变化，发现术后ctDNA阳性患者复发风险显著增高(HR:4.58)，首次提出TNMB分期系统可显著提升预后预测精度(C-index:0.80 vs 0.65)，为ESCC术后精准管理提供重要生物标志物。

　　

食管癌是全球范围内最具威胁的消化道恶性肿瘤之一，2022年数据显示其发病率位居全球第11位，而死亡率高居第7位，每年导致约44.5万人死亡。中国作为食管癌高发地区，承担了全球近半数的发病和死亡负担，其中约90%的病例为食管鳞状细胞癌(ESCC)。虽然手术切除是目前主要的治疗手段，但患者术后5年生存率仅约25%，多数治疗失败源于术后残留的微小病灶引发的复发和转移。

传统的影像学检查方法在检测分子残留疾病(MRD)方面存在明显局限——当影像学能够发现复发灶时，肿瘤细胞数量往往已超过千万级，此时再干预为时已晚。因此，开发高灵敏度的MRD检测技术成为改善食管癌患者预后的关键突破点。

循环肿瘤DNA(ctDNA)检测技术为解决这一难题带来了希望。ctDNA是肿瘤细胞凋亡或坏死释放到血液中的DNA片段，能够实时反映肿瘤的基因突变信息。由于其半衰期短(<2小时)，ctDNA非常适合用于术后肿瘤动态的实时监测。尽管ctDNA在结直肠癌等瘤种的MRD检测中已显示出重要价值并被纳入临床指南，但在食管鳞癌中的研究仍相对缺乏。

在此背景下，Cai-Yan Fang等研究人员在《Molecular Biomedicine》上发表了一项重要研究，通过超高通量测序技术深入探索了ctDNA在ESCC术后MRD检测中的价值。研究人员从125例接受根治性手术的II-IVA期ESCC患者中收集了62例原发肿瘤组织、108例术前和125例术后血浆样本，采用437基因Panel进行肿瘤组织测序，196基因Panel进行血浆ctDNA测序，使用自动化三重筛选测序(ATG-seq)技术达到0.01%的检测灵敏度。

研究结果显示，肿瘤组织与术前血浆样本的突变检测一致性高达91.11%(p=0.62)。术后ctDNA阳性患者的复发率显著高于阴性患者(66.67% vs. 21.54%，p<0.001)，且与更差的疾病无生存期(DFS)(风险比[HR]:4.58)和总生存期(OS)(HR:5.39)显著相关。术前ctDNA阳性和术后ctDNA未清除(ctDNA-nonclearance)同样预示着不良预后。

值得注意的是，研究人员创新性地将术后ctDNA状态与传统TNM分期结合，提出了TNMB(Tumor-Node-Metastasis-Blood)分期系统。这一新系统能够更好地区分不同预后患者(p<0.001)，在预测准确性上显著优于传统TNM分期(DFS的C-index:0.80 vs. 0.65；OS的C-index:0.77 vs. 0.69)。

突变谱特征分析

研究人员通过对62例肿瘤组织、108例术前血浆和125例术后血浆样本的测序分析，发现了ESCC中高频突变的基因包括TP53、CCND1、PIK3CA、CDKN2A、ROS1和ALK等。其中TP53在肿瘤组织、术前血浆和术后血浆样本中的突变频率分别为90.3%、56.5%和28.0%，居各基因之首。通路富集分析显示，这些高频突变基因主要富集于细胞周期、细胞衰老、p53信号通路和FoxO信号通路等四个关键通路。

肿瘤组织与血浆ctDNA比较

通过对比分析，研究人员发现术前血浆与肿瘤组织的突变检测一致性高达91.11%，具有"几乎完全一致"的吻合度(PABAK=0.82)。研究人员还将ctDNA中的突变分为两类：肿瘤知情突变(tumor-informed mutations，源自肿瘤组织的追踪突变)和肿瘤初始突变(tumor-naive mutations，仅在血浆中检测到的独特变异)。令人惊讶的是，无论是肿瘤知情突变还是肿瘤初始突变，都与较差的DFS和OS相关，且两组间无显著差异(p=0.98)。这一发现表明，仅依靠肿瘤知情分析可能会遗漏高风险患者，而整合两种方法可以提高ctDNA突变检测能力。

ctDNA检测与病理分期关系

研究发现，随着病理分期的进展，术前ctDNA阳性率呈现上升趋势：II期患者为70.97%，III期患者为92.11%，IVA期患者为87.50%(p=0.027)。术后ctDNA检测率也随分期升高而增加：II期患者为41.18%，III期患者为52.08%，IVA期患者为77.78%(p=0.10)。此外，ctDNA的相对丰度(最大VAF×cfDNA浓度)和突变数量也随分期进展而增加。

研究人员还分析了108例配对术前术后血浆样本的ctDNA状态转换模式。在22例术前ctDNA阴性患者中，21例(95.5%)保持持续阴性，仅1例(4.5%)术后转为阳性。在86例术前ctDNA阳性患者中，39例(45.4%)转为阴性(ctDNA清除)，47例(54.6%)保持阳性(ctDNA未清除)。值得注意的是，ctDNA清除率随分期进展呈下降趋势：II期患者为47.73%，III期患者为48.57%，IVA期患者仅为14.29%。

ctDNA状态与复发风险

整个队列的复发率为43.20%，且随病理分期进展而增加：II期患者为32.35%，III期患者为52.08%，IVA期患者为77.78%(p=0.010)。术前ctDNA阳性患者的复发率显著高于阴性患者(50.0% vs. 18.18%，p=0.014)，且DFS较差(p=0.016)，OS有变差趋势(p=0.071)。

最为重要的是，术后ctDNA阳性患者的复发率显著高于阴性患者(66.67% vs. 21.54%，p<0.001)，DFS(20.30月 vs. 未达到，HR:4.58)和OS(38.22月 vs. 未达到，HR:5.39)都显著较差。多因素Cox回归分析进一步证实，术后ctDNA阳性是DFS(HR:4.10)和OS(HR:5.38)的独立预后因素。

TNMB分期系统的建立

基于以上发现，研究人员将术后ctDNA检测状态与传统病理TNM分期结合，建立了TNMB分期系统。具体标准为：病理II期且ctDNA阴性、病理III期且ctDNA阴性定义为TNMB 1期；病理II期且ctDNA阳性、病理IVA期且ctDNA阴性定义为TNMB 2期；病理III期且ctDNA阳性、病理IVA期且ctDNA阳性定义为TNMB 3期。

这一新分期系统在区分患者预后方面显著优于传统TNM分期(p<0.001)。时间依赖性ROC曲线显示，TNMB在不同时间点对DFS和OS的预测准确性均高于TNM分期。在外部验证队列中，TNMB同样保持了更好的预后判别能力(PFS:0.75 vs. 0.71；OS:0.80 vs. 0.72)。

讨论与结论

本研究通过高通量测序技术证实了术后ctDNA检测在ESCC MRD评估中的重要作用。术后ctDNA阳性与高复发风险和不良生存预后显著相关，且是独立的预后因素。研究人员提出的TNMB分期系统整合了分子生物学信息，能够更精确地进行风险分层，为个体化治疗决策提供依据。

与既往研究相比，本研究的ctDNA检测率较高(术前79.63%，术后48.00%)，这可能归因于0.01%的超高检测灵敏度、约30,000×的测序深度、大Panel(437基因)的使用以及肿瘤知情和肿瘤初始方法的整合。

研究发现13个特定基因突变(TP53、SDHA、ATR、NFKBIA、FANCI、ATRX、LRP1B、NFE2L2、CDKN2A、TUBB3、ATM、PIK3CA、VHL和ATR)与不良生存结果显著相关，其中TP53和SDHA突变在血浆中显示出较强的预后价值。

研究的局限性包括其回顾性设计、单时间点ctDNA检测以及未纳入接受新辅助或辅助治疗的患者。未来需要前瞻性研究来验证这些发现，并探索多时间点ctDNA监测在早期复发检测中的价值。

总之，这项研究确立了术后ctDNA阳性作为ESCC术后MRD检测的有效生物标志物，其开发的TNMB分期系统为ESCC的精准预后评估提供了新工具，有望指导临床治疗决策并改善患者预后。随着液体活检技术的不断发展和临床应用的深入，ctDNA指导的个体化治疗策略将为食管癌患者带来新的希望。