平行离线呼气采样交叉验证挥发性有机化合物代谢物分析：提升呼气生物标志物研究的可靠性与保真度

　　针对呼气挥发性有机化合物(VOC)生物标志物研究中缺乏标准化采样方法、假阳性风险高的问题，本研究采用固相微萃取(SPME)结合气相色谱-质谱(GC-MS)两种离线采样方法（DB-SPME与低温转移法），对158名健康志愿者进行交叉验证分析。研究发现两种方法定量结果高度一致，鉴定出>30种呼气VOCs，其中11种分析物显著相关(p<0.05)，且纵向样本重现性更优。该研究为呼气VOC分析提供了可靠的交叉验证框架，显著提升了生物标志物发现的可靠性。

　　

呼气分析作为非侵入性健康监测手段，自古希腊希波克拉底时代便受到关注，近年来因分析技术进步而焕发新生。呼气中的挥发性有机化合物(VOCs)作为潜在疾病生物标志物，在糖尿病、肺癌、COVID-19和心力衰竭等疾病诊断中展现出巨大潜力。然而，该领域长期面临重大挑战：缺乏 universally accepted 的标准化采样方法，导致不同研究结果难以比较，假阳性发现风险高，且健康人群基线VOC谱系定义不清。尽管近期研究通过单一方法（如ReCIVA采样器结合热脱附GC-MS）尝试建立健康呼气VOC数据库，但仅依赖单一方法可能引入方法学偏差，降低结果可靠性。

为破解这一难题，研究团队创新性地采用两种平行离线采样方法——直接呼气固相微萃取(DB-SPME)和泰德拉袋低温转移法——对健康人群呼气VOC进行交叉验证分析。该研究发表于《Metabolomics》，通过双方法互证显著提升了呼气VOC分析的可信度。

研究团队招募158名健康志愿者提供一次性交叉样本，其中10人额外提供9次纵向样本（跨度6个月）。关键技术方法包括：1）DB-SPME直接采样（通过病毒过滤器连接SPME纤维，采集48L呼气）；2）泰德拉袋采集后低温转移至顶空瓶；3）气相色谱-四极杆飞行时间质谱(GC-QTOF MS)分析；4）严格数据处理流程（包括背景扣除、显著性筛选等）；5）统计分析与化学计量学方法（层次聚类、相关性分析、主成分分析等）。所有样本均同步采集环境空气作为背景对照。

3.1 呼气采集与研究人群特征

158名志愿者（51%女性，49%男性，中位年龄27岁）提供交叉样本，10人提供纵向样本（99份）。血液生化检查确认所有参与者相对健康，人口统计学特征代表典型大学人群。

3.2 健康呼气中的VOC鉴定

经过严格数据筛选（去除纤维伪影、低丰度化合物、背景污染等），DB-SPME鉴定出32种显著富集于呼气的VOCs，低温转移法鉴定出35种。两类方法检测的VOC分子量分布差异显著：DB-SPME主要捕获中等分子量（NPRI 550-1041）化合物，而低温转移法对高分子量（NPRI 898-1646）VOCs更敏感。功能基团分析显示两类方法检测的VOCs结构高度相似，以萜类/萜烯类和非芳香环状化合物为主。

3.3 方法内与方法间VOC相关性

层次聚类热图显示，两类方法中结构相似的萜类化合物（如α-蒎烯、β-蒎烯、对伞花烃、柠檬烯等）均呈现同源聚类趋势。相关性分析证实萜类化合物在两类方法内部显著相关（如DB-SPME中α-蒎烯/β-蒎烯R²=0.57, p=1.2×10^?28）。特别重要的是，12种共有VOCs中11种在两类方法间显示显著定量相关性（如对伞花烃R²=0.51, p=2.5×10^?22；α-蒎烯R²=0.49, p=1.2×10^?21），证明两种方法定量结果高度一致。

3.4 VOC变异性基准测试

重现性评估显示，纵向样本的VOC相对标准偏差(RSD)显著低于交叉样本（DB-SPME: p=0.005；低温转移法: p=0.0001），表明个体内变异小于个体间变异。两类方法中，交叉样本与纵向样本的RSD值显著相关（DB-SPME R²=0.22, p=0.004；低温转移法 R²=0.46, p=5.2×10^?6），进一步验证了方法可靠性。

3.5 样本队列的生物学特征

纵向志愿者间多种VOCs存在显著差异（DB-SPME中18种、低温转移法中15种），提示这些化合物可能具有生物学相关性。性别分析显示男性呼气中异戊二烯（与肌肉脂解胆固醇代谢相关）和乙硫醇显著升高，主成分分析(PCA)未能基于VOC谱区分性别，反映健康人群VOC表达受多因素影响。

研究结论强调，平行采样策略通过交叉验证极大提升了呼气VOC分析的可靠性。两类方法在定量结果、VOC相关性及重现性模式上高度一致，显著降低了假阳性发现风险。研究发现萜类/萜烯类化合物在健康呼液中普遍存在且呈现高度相关性，可能源于外源性暴露（食物、消费品等）与内源性代谢相互作。研究还证实纵向采样重现性优于交叉设计，为未来研究设计提供重要参考。

该研究的核心意义在于为呼气VOC研究建立了严谨的验证框架。在缺乏金标准采样方法的现状下，采用多方法平行分析成为提升结果可靠性的关键策略。作者建议未来研究至少采用两种采样方法，并通过多中心合作或社区驱动数据库进一步验证结果。这一方法论创新不仅推动了健康呼气VOC基线谱系的建立，更为呼气生物标志物向临床转化奠定了坚实基础。