二甲基亚砜预处理增强人诱导多能干细胞向肾类器官分化的效率及机制研究

　　为解决hiPSCs分化为肾类器官效率低、异质性高等问题，研究人员开展DMSO预处理对hiPSCs多能性状态及肾向分化影响的研究。发现1% DMSO处理可通过调控细胞周期、表观遗传和形态重塑，显著提升SIX2+肾祖细胞比例（92%）和肾类器官生成成功率（78%），为疾病建模和药物筛选提供优化策略。

　　

在再生医学和疾病建模领域，人诱导多能干细胞（hiPSCs）因其能够分化为任何成人细胞类型而备受瞩目。然而，尽管自山中伸弥团队开创性工作以来技术不断进步，hiPSCs在生成复杂多细胞结构（如肾类器官）时仍面临分化效率低、成熟度不足和脱靶细胞群出现等挑战。肾类器官作为模拟胎儿肾脏发育的重要模型，在肾病机制研究、药物毒性筛选和潜在再生疗法中具有广阔前景，但现有分化协议（如Morizane等2017年建立的方案）仍需优化起始hiPSCs群体状态以提升效率。

为突破这一瓶颈，Helen Kearney等研究人员在《Stem Cell Reviews and Reports》发表研究，探讨了低剂量二甲基亚砜（DMSO）预处理对hiPSCs多能性状态、表观遗传调控及后续肾类器官分化的影响。研究团队通过细胞培养、流式细胞术、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、免疫荧光染色和功能实验等技术，系统评估了DMSO处理对hiPSCs细胞周期、多能性标志物、 colony形态和分化轨迹的作用，并利用Morizane肾类器官分化协议验证其对肾祖细胞（NPC）和成熟类器官生成效率的提升效果。

材料与方法

研究使用三种hiPSCs细胞系（LUMC、H101和H107），均在Geltrex包被的培养板上用mTeSRplus培养基维持。分化前，hiPSCs经1-2% DMSO处理24小时，随后按Morizane协议进行肾类器官分化，依次使用CHIR99021（Wnt激动剂）、Noggin（BMP抑制剂）、Activin A和FGF9诱导中胚层和肾祖细胞。关键实验包括：流式细胞术检测多能性标志物（OCT4、SOX2、SSEA3/4）和SIX2⁺细胞比例；scRNA-seq分析转录组和表观遗传相关基因；实时成像追踪colony形态变化；免疫荧光染色评估肾类器官结构蛋白（如PODXL、Megalin、GATA3）；LDH释放和氧化应激实验评估细胞毒性。

研究结果

Pluripotency and Differentiation Potential

DMSO处理导致hiPSCs G1期细胞比例增加（细胞周期停滞），细胞总数减少但增殖标志物Ki67表达未显著抑制。LDH释放实验表明DMSO引起轻度细胞毒性，但未引发明显氧化应激。多能性转录因子（OCT4、NANOG）表达下调，而表面标志物（SSEA3/4、TRA-1-60/81）维持稳定。scRNA-seq显示DMSO下调细胞周期相关基因（CCND1/2/3、CDC25A）和表观遗传调控因子（DNMT3A/B、TET酶），提示多能性状态向更易分化的"primed state"转变。

Changes in hiPSC Colony Morphology Following DMSO Treatment

实时成像显示DMSO处理使hiPSCs colonies更小、更圆（凸度和圆形度增加），边缘细胞突起减少。这种形态变化与更高分化潜能的epiblast spheroid结构相似，且colony数量增加利于分化起始。

HiPSC Structural Rearrangement and Integrin Binding

细胞骨架染色显示DMSO处理减弱了F-actin应力纤维和黏着斑形成。基因表达分析发现整合素（ITG-β1、ITG-β5）和黏附分子（CDH2、PTK2）下调，表明细胞-基质相互作用改变。部分colony出现中央 lumen结构和顶底极性标志物（PODXL、ZO-1）表达，进一步支持向primed state转变。

Inducing Mesoderm Induction Following DMSO Treatment of hiPSCs

DMSO预处理减少了分化早期（第2-4天）的细胞死亡，并抑制了脱靶内胚层（SOX17）和心系中胚层（NKX2.5）分化。中胚层标志物（TBXT、MIXL1）成功诱导，且1% DMSO组中间中胚层标志物PAX2表达提前上调，提示肾向分化加速。

Metanephric Mesenchyme Nephron Progenitor Differentiation

第9天分化时，1% DMSO处理组SIX2⁺肾祖细胞比例最高（92% vs 对照69%），细胞回收数量翻倍。免疫荧光证实SIX2和PAX2蛋白共表达，表明高质量NPC生成。

Kidney Organoid Differentiation

第21天类器官生成成功率在1% DMSO组达78%（对照38%），且类器官中近端小管（Megalin）和远端小管/集合管（GATA3）标志物表达增强，结构更完整。三种hiPSCs系均验证了这一趋势。

结论与讨论

本研究证实短期低剂量DMSO预处理可通过调控hiPSCs细胞周期、表观遗传和形态动力学，增强其向肾祖细胞和肾类器官的分化效率。1% DMSO为最优浓度，能显著提升SIX2⁺NPC比例和类器官生成率，同时减少脱靶分化。这种简单、可重复的策略解决了肾类器官分化中的关键瓶颈，为高通量药物筛选和疾病建模提供了更可靠的细胞模型。未来需进一步探索DMSO诱导的表观遗传重编程机制，并将其整合到其他类器官分化协议中，以验证其普适性。