基于机制模型发现色瑞替尼通过破坏核膜完整性治疗儿童高危肝肿瘤的新策略

　　本研究针对儿童高危肝肿瘤治疗挑战，利用患者特异性数字孪生模型进行药物反应模拟，发现ALK抑制剂色瑞替尼(Ceritinib)通过抑制核孔蛋白(NUPs)表达破坏核膜完整性，诱导线粒体核周聚集和ROS产生，最终导致肿瘤细胞凋亡。该研究为儿童肝肿瘤提供了新型靶向治疗策略，彰显计算模型在精准医疗中的价值。

　　

儿童肝肿瘤是儿科领域最具挑战性的恶性肿瘤之一，其中肝母细胞瘤(HB)作为最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，多发生于5岁以下婴幼儿。虽然近年来通过手术技术革新、肝移植应用和化疗方案优化，标准风险患者的生存率已提升至80%以上，但高危患者群体仍面临治疗困境。这些患者通常伴有转移性疾病、血管侵犯、肝外肿瘤扩散、PRETEXT 4期肿瘤或年龄较大等高风险特征，对包括顺铂和多柔比星在内的强化化疗方案反应不佳，且长期副作用显著。更令人担忧的是，肝细胞癌(HCC)和具有HCC样特征的肝母细胞瘤(TLCT)在较大儿童和青少年中同样预后不良。传统经验性治疗策略无法充分考虑患者个体差异和肿瘤异质性，导致治疗效果有限。因此，开发针对高危儿童肝肿瘤的个性化治疗策略和寻找可操作的分子靶点成为当务之急。

在这项发表于《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》的研究中，Salih Demir等研究人员通过整合临床、遗传和转录组数据，构建了高危儿童肝肿瘤患者的数字孪生模型，利用机制模型进行计算机药物反应模拟，发现色瑞替尼(Ceritinib)作为最具潜力的治疗选择，并通过多层面实验验证了其疗效和作用机制。

研究人员采用了几项关键技术方法：利用13例高危儿童肝肿瘤样本及其对应正常组织进行RNA测序分析；采用ModCellTM机制建模平台构建个体化ODE模型进行药物反应模拟；建立包含5种肝肿瘤细胞系和7种PDX细胞系的药物测试平台进行体外验证；通过Western blot、荧光显微成像和流式细胞术分析分子机制；使用PDX小鼠模型进行体内疗效评估。

计算虚拟患者机制细胞模型预测色瑞替尼作为儿童肝肿瘤候选药物

研究人员首先对13例具有个体高风险特征的儿童肝肿瘤患者进行了遗传测试和RNA测序，发现CTNNB1突变是最普遍的遗传改变(11/13)。通过主成分分析和层次聚类，肿瘤样本与正常肝组织样本在表达谱上明显分离。基因集富集分析(GSEA)显示Wnt信号通路和MYC靶基因在肿瘤样本中共同富集。研究人员利用ModCell机制模型，基于癌症相关信号通路(如Hedgehog、Wnt、RAS/MAPK和PI3K/AKT/MTOR信号通路)构建了分子相互作用网络，选择"CTNNB1/Wnt激活"作为模型激活因子，"核MYC:MAX复合物"作为细胞存活表型效应的读数。通过将这些生物网络基于转录组数据个体化，生成了13例高危儿童肝肿瘤患者的数字孪生模型。

药物反应模拟显示，色瑞替尼在所有样本中表现出强烈的抑制效果，且对肿瘤样本具有选择性，对正常肝组织样本影响较小。代表性药物反应曲线显示，携带多个临床高风险标准的患者1100对色瑞替尼暴露表现出显著的预测生长抑制，而正常肝组织则不受影响。值得注意的是，无论肿瘤亚型和临床参数如何，包含突变状态并不会显著改变药物预测，强调了色瑞替尼作为所有类型儿童肝肿瘤通用治疗候选物的潜力。

色瑞替尼通过ALK非依赖性激酶抑制阻碍肝肿瘤生长

虽然色瑞替尼主要被认为是选择性ALK抑制剂，但Western blot分析显示在任何肝肿瘤模型中均未检测到ALK蛋白，排除了色瑞替尼抗肿瘤作用通过ALK抑制介导的可能性。重要的是，当研究人员测试其他六种选择性ALK抑制剂时，发现色瑞替尼是迄今为止最有效的化合物，其效果与多柔比星相当，远强于标准治疗药物顺铂。通路富集分析显示，色瑞替尼显著下调了粘附连接、 mechanistic target of rapamycin kinase(MTOR)、PI3K-AKT和mitogen-activated protein kinase(MAPK)信号通路。Western blot分析验证了这些发现，色瑞替尼暴露显著降低了这些通路关键成分的磷酸化水平，包括focal adhesion kinase(FAK)、MTOR、AKT和ERK1/2蛋白，表明色瑞替尼通过损害其激活来干扰其原发性靶点以外的多个激酶并消除相应的信号通路。

色瑞替尼下调核孔蛋白导致核孔复合体失调

为了解色瑞替尼暴露的分子后果，研究人员对两个高危PDX细胞模型(PDX282和PDX303)进行了RNA测序，比较发现色瑞替尼处理后分别有31个和534个基因显著上调和下调超过两倍。基因本体论分析和KEGG通路分析强调了核膜和核质运输相关术语的显著富集。基因集富集分析显示，色瑞替尼严重介导了与"mRNA核输出"相关基因的转录下调，这些负富集基因集主要由核孔蛋白(NUPs)组成，这些是核孔复合体(NPC)的重要结构成分，促进核质货物输出和输入。具体而言，外环复合体的两个主要成分NUP133和NUP160，以及中央通道 spoke环复合体的两个主要NUPs NUP205和NUP155，在色瑞替尼处理后均显著抑制。值得注意的是，对高危肿瘤患者队列以及JPLT-2试验的更大独立队列的分析显示，与正常肝组织相比，肿瘤组织中这四种NUPs显著富集和转录上调。Western blot分析在蛋白质水平上验证了NUPs在色瑞替尼暴露后的下调。

色瑞替尼诱导的核膜破坏触发ROS积累和肿瘤细胞死亡

RNA测序数据提示肿瘤样本中核膜失调，研究人员通过量化具有完整或破裂核膜的细胞来检查色瑞替尼处理对核膜的结构影响。与基因本体论和通路富集分析一致，色瑞替尼暴露诱导约80%的细胞发生核膜破裂，而对照细胞大多保持完整的细胞核。虽然色瑞替尼抑制了MTOR、AKT、FAK和ERK1/2的磷酸化，但使用相应药理抑制剂的处理导致激酶活性丧失，但核膜保持完整，表明激酶活性的抑制不是核膜破坏的原因，而是其结果。荧光显微镜和流式细胞术均证实，与未处理的对照相比，色瑞替尼处理的肿瘤细胞中ROS水平显著增加。重要的是，ROS通路在患者队列中负富集，突出了肿瘤细胞中ROS依赖性细胞死亡机制的失调。免疫荧光评估显示，色瑞替尼暴露通过显示不规则的核形态和核收缩显著降低核圆形度和核面积，表明色瑞替尼暴露后核结构的破坏。由于大部分细胞ROS来自线粒体，研究人员检查了色瑞替尼处理后的亚细胞定位，观察到暴露于色瑞替尼的细胞中线粒体的核周聚类显著升高，而对照细胞的线粒体显示更均匀的细胞质分布。值得注意的是，色瑞替尼处理的肿瘤细胞的活性caspase 3/7染色显示凋亡细胞显著增加，表明核膜破坏和线粒体重定位有助于程序性细胞死亡。

色瑞替尼在体外和体内抑制肿瘤细胞生长

通过免疫荧光染色显示，色瑞替尼暴露后增殖细胞数量显著降低，抑制了肝肿瘤细胞生长。集落形成 assay清楚证明了色瑞替尼在长期培养条件下的生长抑制特性，色瑞替尼处理的模型形成的集落少于未处理的对照。为了在更生理相关的环境中测试色瑞替尼的功效，研究人员测试了其对已建立的肝肿瘤球体的影响，三维模型更好地模拟患者条件。色瑞替尼处理不仅停止了肿瘤球体的生长，而且还显著减小了其体积，而对照球体继续生长。划痕实验表明，肿瘤细胞的伤口愈合能力明显受损，色瑞替尼暴露后仍有开放的划痕间隙，而对照细胞完全闭合了伤口。

为了在临床前体内环境中探索色瑞替尼的功效，研究人员使用已建立的患者来源异种移植模型，其中高度增殖和CTNNB1突变的HB肿瘤PDX282在免疫缺陷小鼠中皮下传播。经过三周的初始潜伏期后，小鼠接受口服50 mg/kg体重的色瑞替尼或载体治疗，每周5天，持续16天。与载体处理的小鼠相比，色瑞替尼处理的小鼠肿瘤体积显著减小，存活期延长。重要的是，在治疗期间没有观察到体重的剧烈变化，也没有发现外观和行为的变化。随后对处理的肿瘤标本进行组织学检查，发现了嗜酸性残余物和浓缩细胞核的复发区域，这些提示细胞死亡和肿瘤组织完整性的破坏。同时，这些区域对cleaved caspase-3(凋亡标志物)染色阳性。此外，色瑞替尼处理肿瘤的免疫荧光染色显示，与载体处理的肿瘤组织相比，Ki67阳性增殖细胞数量显著减少。

为了研究色瑞替尼与顺铂(当前治疗HB患者的治疗骨干)联合的潜在临床益处，研究人员对两个HB模型进行了成对药物组合实验。四点剂量反应矩阵显示，顺铂和色瑞替尼的组合在纳摩尔剂量下已经实现了非常高的协同得分，与顺铂和多柔比星观察到的相当。

本研究通过机制模型和虚拟患者模拟展示了在高危儿童肝肿瘤中识别有效疗法的潜力。通过整合多维临床和分子数据生成数字孪生，研究人员确定了色瑞替尼作为有前景的治疗候选物。其在体外和体内的功效验证揭示了通过涉及破坏核完整性的新机制的强大抗肿瘤活性。这些发现支持色瑞替尼作为靶向治疗选择，并强调了计算模型在指导精准肿瘤学中的价值。研究表明，色瑞替尼作为一种多面性化合物，同时干扰儿童肝癌中激活的各种信号通路，且不依赖于ALK表达。这项研究强化了基于机器学习的技术在追求癌症治疗中实现精确、安全和有效的药物预测和重新定位方面的潜力。