Ambroxol（氨溴索）局部镇痛新机制：靶向抑制人Nav1.8及双向调控TRPV1/TRPA1的体外药理学研究

　　本研究针对神经病理性疼痛的局部治疗需求，探究了氨溴索（Ambroxol）对疼痛关键靶点人源Nav1.8、TRPV1和TRPA1的调控作用。发现氨溴索对人Nav1.8抑制存在显著种属差异（IC50 279 μM），且高浓度可激活并抑制TRPV1/TRPA1。该研究为氨溴索的局部镇痛应用提供了分子药理学基础，揭示了其多靶点作用特征。

　　

神经病理性疼痛的治疗一直是临床面临的重大挑战。系统性给药虽然有效，但常伴随显著副作用，限制了其应用剂量和疗效。局部外用药物如利多卡因和辣椒素（Capsaicin）虽能避免全身性不良反应，并被推荐用于局部神经病理性疼痛治疗，但可用药物种类有限，亟需拓展新的治疗选择。黏液溶解剂氨溴索（Ambroxol）在临床前研究和病例报告中显示出缓解神经病理性疼痛的潜力，但其镇痛作用的分子机制尚未明确，尤其缺乏对关键人源疼痛靶点的系统药理学研究。

为填补这一知识空白，并回应学界对氨溴索镇痛机制进行深入研究的呼吁，由Stefanie Hefner、George Oprita、Sebastian Pantke、Axel Hage和Andreas Leffler组成的研究团队开展了一项深入的体外研究，旨在探究氨溴索对人源Nav1.8（电压门控钠离子通道1.8亚型）、TRPV1（瞬时受体电位香草素亚型1）和TRPA1（瞬时受体电位锚蛋白亚型1）的调控作用。其研究成果发表在《The Journal of Pain》上，为氨溴索的局部镇痛应用提供了坚实的理论依据。

本研究主要采用了以下几种关键技术方法：1. 分子生物学与细胞模型构建：利用人胚胎肾细胞（HEK 293/293T）和神经母细胞瘤细胞（ND7/23）分别瞬时或稳定转染表达人源、大鼠源或突变体的人TRPV1、TRPA1及Nav1.8通道蛋白。2. 全细胞膜片钳技术（Whole-cell patch clamp）：系统评估了氨溴索对上述离子通道的激活、抑制、电流强度及动力学特性的影响，并计算了半数抑制浓度（IC₅₀）。3. 比率钙成像（Ratiometric calcium imaging）：使用Fura-2-AM染料监测氨溴索应用后细胞内钙离子浓度的变化，以评估其对通道功能的影响及钙信号来源。所有实验均在细胞系上进行，未使用原代人体或动物组织。

研究结果

1. Ambroxol抑制Nav1.8表现出显著的种属特异性

研究人员在表达人Nav1.8（hNav1.8）和大鼠Nav1.8（rNav1.8）的ND7/23细胞上进行了全细胞膜片钳记录。结果发现，氨溴索对rNav1.8的抑制效力（IC₅₀ = 18 μM）远高于对hNav1.8的抑制（IC₅₀ = 279 μM），甚至低于对ND7/23细胞内源性TTX（河豚毒素）敏感钠通道的抑制（IC₅₀ = 76 μM）。这表明氨溴索并非人Nav1.8的选择性或高效抑制剂。一个有趣的发现是，氨溴索对hNav1.8和rNav1.8通道在20 ms去极化脉冲末期产生的不失活“持续电流”的抑制效力，比其对瞬态峰值电流的抑制强约5倍（hNav1.8持续电流IC₅₀ = 49 μM）。这提示氨溴索可能作为一种有效的“开放通道”阻滞剂发挥作用。

2. 高浓度Ambroxol激活hTRPV1和hTRPA1

通过钙成像技术，研究发现高浓度（1000 μM）的氨溴索能引起表达hTRPV1或hTRPA1的HEK 293细胞以及未转染的 na?ve 细胞内的钙离子浓度小幅但显著升高，且在通道表达细胞中的效应更强。膜片钳实验进一步证实，氨溴索可在表达hTRPV1的细胞上诱发出具有外向整流特性的微小电流。该激活作用似乎与辣椒素结合域有关，因为对辣椒素不敏感的兔源TRPV1（oTRPV1）不被氨溴索激活，但对辣椒素不敏感的大鼠突变体TRPV1-Y511A却仍能被激活，表明其结合位点与辣椒素不同。

3. Ambroxol抑制hTRPV1

研究的一个重要发现是，氨溴索能以浓度依赖的方式抑制由辣椒素激活的hTRPV1电流。这种抑制在1000 μM时最为显著（抑制78%），且部分不可逆。这种抑制不依赖于细胞内钙离子浓度，因为在使用钙螯合剂BAPTA或表达对钙依赖性失敏不敏感的突变体hTRPV1-Y672K的实验中，抑制效应依然存在。此外，氨溴索也能抑制由质子（pH 6.0）激活的hTRPV1电流，但效果不如抑制辣椒素电流那么稳健。

4. Ambroxol对hTRPA1的激活与抑制

对于hTRPA1，氨溴索在极高浓度（3000 μM）下可激活该通道，产生大的内向电流，并可被特异性拮抗剂A967079所抑制。更有意义的发现是，较低浓度的氨溴索（100-1000 μM）能浓度依赖性地抑制由芥子油（AITC）或香芹酚（carvacrol）激活的hTRPA1电流，且对外向电流的抑制强于内向电流。机制研究表明，氨溴索对hTRPA1的激活不依赖于通道细胞内关键的半胱氨酸残基（突变体hTRPA1-3C仍被激活），但可能与介导薄荷醇、香芹酚敏感的Ser873/Val874位点有关（突变体hTRPA1-S873V/T874L的激活大幅减弱）。

结论与意义

本研究系统评估了氨溴索对疼痛治疗中三个关键离子通道靶点的人源同源物的药理学作用，得出了若干重要结论。首先，氨溴索确实能抑制人Nav1.8，但其效力远低于对大鼠Nav1.8的抑制，且低于对其它TTX敏感钠通道的抑制，因此不能将其视为一种选择性或强效的人Nav1.8抑制剂。其镇痛作用可能源于对多种钠通道的非选择性阻滞。其次，研究首次发现高浓度的氨溴索可双向调节TRPV1和TRPA1，即微弱激活和显著抑制。这种对TRP通道的抑制，尤其是对TRPV1的抑制，可能与其在表达高水平TRPV1的神经纤维（如糖尿病神经病变中的痛性纤维）上产生镇痛效应有关。

该研究的深刻意义在于：1. 澄清了种属差异：强调在药物开发中从临床前模型（大鼠）过渡到人源靶点验证的极端重要性，氨溴索对大鼠Nav1.8的高效抑制并不能直接外推至人类。2. 揭示了多靶点作用机制：氨溴索的镇痛作用可能是一个多靶点协同效应的结果，包括抑制钠通道（Nav1.8, Nav1.7等）和抑制TRPV1/TRPA1，这为其局部外用的有效性提供了更全面的分子药理学解释。3. 指导临床实践与未来研究：研究结果支持对氨溴索进行更深入的临床研究，以验证其局部治疗神经病理性疼痛的疗效。同时，研究表明要达到调控TRP通道的浓度极高，这提示局部用药时药物的表皮渗透能力是实现疗效的关键，未来研究应关注其局部药代动力学。

总之，这项研究为氨溴索作为一种老药新用于疼痛治疗提供了坚实的体外药理学数据，揭示了其复杂而多方面的作用机制，为后续的转化研究和临床应用奠定了重要的理论基础。