靶向结核分枝杆菌拓扑异构酶I的DNA切割与链通过活性抑制机制研究

　　为解决结核病耐药性问题，研究人员针对结核分枝杆菌唯一DNA松弛酶——拓扑异构酶I（TopoI）开展单克隆抗体（mAb）抑制研究。他们发现特异性mAb 1D9D10通过独特双机制抑制酶活性：既阻断DNA切割步骤（第一步转酯反应），又抑制链通过（strand passage）活性。该研究首次揭示DNA拓扑结构改变发生于链通过而非初始切割步骤，为开发抗耐药结核病的新型肽类抑制剂提供了关键靶点与工具抗体。

　　

在全球结核病防治形势依然严峻的背景下，耐药结核分枝杆菌的涌现对现有治疗方案构成了巨大挑战。结核病作为全球主要致死性传染病之一，其治疗周期长且患者依从性差，导致多药耐药和广泛耐药菌株持续出现。这种现状迫切要求科学家寻找新的药物靶点和创新抑制剂。拓扑异构酶作为调控DNA拓扑结构的关键酶家族，在DNA复制、修复、重组及基因表达等核心生物学过程中发挥重要作用，因而成为抗菌药物开发的重要靶标。

结核分枝杆菌与其他细菌不同，仅依赖一种IA型拓扑异构酶I（TopoI）作为唯一的DNA松弛酶，这意味着该酶对细菌存活具有不可替代的作用。前期研究表明，敲低结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌中TopoI基因会导致细胞死亡，充分验证了其作为药物靶标的潜力。尽管TopoI已被确证为理想靶点，但针对细菌IA型拓扑异构酶的抑制剂仍然有限，且已发现的小分子抑制剂多作为DNA嵌入剂发挥作用，缺乏足够的特异性。

为解决这一瓶颈问题，印度科学研究所Valakunja Nagaraja教授团队另辟蹊径，采用单克隆抗体（mAb）技术探索新型抑制策略。他们从前期构建的大量抗结核分枝杆菌TopoI的单克隆抗体库中，发现了一个具有独特抑制机制的高亲和力抗体1D9D10。这项创新性研究成果发表在《Nucleic Acids Research》，揭示了该抗体通过双重作用机制抑制酶活性的新颖方式，并为理解TopoI催化机制提供了重要见解。

研究人员运用多种关键技术方法开展研究：通过蛋白质纯化技术获得高纯度结核分枝杆菌TopoI（Mt TopoI）、耻垢分枝杆菌TopoI（Ms TopoI）和大肠杆菌TopoI（Ec TopoI）；采用尺寸排阻色谱（SEC）分析抗体-酶复合物的化学计量关系；利用电泳迁移率变动分析（EMSA）评估DNA结合活性；通过质粒切口实验和寡核苷酸切割实验检测DNA切割活性；设计创新的免疫沉淀实验分析链通过活性；应用微量热泳动技术（MST）定量测定抗体与酶的亲和力；并成功构建了单链可变区片段（ScFv）进行功能验证。

mAb特异性结合并抑制分枝杆菌TopoI

研究发现1D9D10 mAb能特异性识别分枝杆菌TopoI，与Mt TopoI和Ms TopoI均发生交叉反应，但不识别大肠杆菌TopoI。尺寸排阻色谱显示mAb与Mt TopoI以2:1的化学计量比形成复合物，表观分子量为390 kDa。DNA松弛实验表明，在摩尔比为2:1（Mt TopoI:mAb）时，酶活性被完全抑制，且对Ms TopoI呈现相似抑制模式，而对Ec TopoI无抑制作用。

ScFv抑制Mt TopoI

研究人员成功测序了mAb的可变区基因，构建并纯化了单链可变区片段（ScFv）。活性实验证明ScFv保持了与完整mAb相当的抑制活性。微量热泳动实验测得ScFv和mAb的解离常数（K_D）分别为129.2±5.45 nM和70.33±7.66 nM，表明ScFv基本重现了mAb的结合特性。

1D9D10不干扰Mt TopoI的DNA结合

电泳迁移率变动分析表明，无论mAb与DNA的加入顺序如何，都能形成超迁移的三元复合物，说明mAb识别表位与DNA结合区域不同。表位作图显示mAb结合于NTD结构域（对应第II和第III结构域），其中第III结构域包含催化酪氨酸残基，第II结构域作为铰链元件促进链通过过程中的构象运动。

mAb抑制Mt TopoI的第一次转酯反应

使用含强拓扑位点（STS）的32聚体寡核苷酸和超螺旋质粒DNA的切割实验均表明，mAb浓度依赖性地抑制DNA切割活性。改变mAb与DNA的预孵育顺序以及在各种温度下进行实验，均不改变抑制效果，表明mAb结合的酶构象受到限制而无法进行切割。

1D9D10不抑制TopoI的DNA再连接

无论是寡核苷酸还是质粒基础的再连接实验均显示，添加Mg²⁺后，切割产物在mAb存在情况下仍能有效再连接，说明mAb不影响酶的第二次转酯反应。值得注意的是，实验中发现mAb存在时再连接产物中超螺旋DNA增加，提示链通过活性可能受到抑制。

mAb干扰Mt TopoI的链通过活性

研究人员设计了创新的免疫沉淀实验来专门分析链通过活性。将TopoI-DNA共价复合物与mAb免疫沉淀并用高盐缓冲液洗涤后，再连接反应仅产生超螺旋产物，而无松弛拓扑异构体，确证mAb抑制链通过活性。使用非抑制性mAb 2B1G5的对照实验显示能正常产生松弛拓扑异构体，排除实验假阳性。

研究结论与讨论部分指出，1D9D10 mAb代表了一种罕见的多步抑制机制，能同时抑制TopoI的DNA切割和链通过活性，而不影响DNA结合和再连接功能。最合理的抑制机制是空间位阻效应，限制了酶进行切割和链通过所需的构象运动。

尤为重要的是，通过mAb干预实验，研究人员精确揭示了DNA拓扑结构改变的时机：只有在链通过步骤完成、缺口重新密封后，DNA的连接数才会发生改变。这一发现深化了对IA型拓扑异构酶工作机制的理解，说明酶桥接的反应模式作为一种故障安全机制，确保连接数变化的精确调控。

与团队先前发现的两种抑制性mAb（1E4F5和2F3G4）相比，1D9D10表现出独特的作用机制。这三种抗体均结合于NTD区域但识别不同表位，导致不同的抑制模式，充分展示了抗体工具在研究酶结构与功能关系中的强大价值。

该研究的科学意义不仅在于发现了一种新型抑制剂，更在于为后续研究开辟了多个方向：mAb的高亲和力特性可用于通过冷冻电镜（cryo-EM）研究酶反应中间态的结构特征；基于CDR区域衍生的肽类及其模拟物可开发具有治疗潜力的新型抑制剂；ScFv为抗体工程提供了分子基础；建立的方法平台可用于筛选更多针对结核分枝杆菌必需酶的抑制剂。

这项研究通过创新性地应用抗体工具，不仅揭示了结核分枝杆菌TopoI的新型抑制机制，还深化了对拓扑异构酶催化过程的理解，为应对耐药结核病的治疗挑战提供了新的研发思路和工具平台，具有重要的科学意义和转化价值。