靶向硫氧还蛋白还原酶新型抑制剂TRi-1/TRi-2类似物的开发及其细胞毒性评估

　　本研究针对人胞质（TXNRD1）和线粒体（TXNRD2）硫氧还蛋白还原酶亚型在癌症治疗中的潜力，开发了TRi-1和TRi-2的新型类似物，包括线粒体靶向的三苯基膦（TPP）衍生物。通过酶学实验和细胞毒性测试，发现这些化合物能有效抑制TXNRD1/TXNRD2活性，并在人肺癌A549和鳞癌FaDu细胞中展现差异毒性，为靶向硫氧还蛋白系统的抗癌药物设计提供了新思路和实验依据。

　　

在癌症研究领域，氧化还原稳态的调控一直是热点话题。细胞内的活性氧（ROS）水平如同一把双刃剑：适度时参与信号传导，促进细胞增殖；过量时则引发损伤甚至细胞死亡。癌细胞通常通过上调抗氧化防御系统来维持较高的ROS稳态，这其中，硫氧还蛋白系统扮演着核心角色。该系统主要包括硫氧还蛋白（Thioredoxin, TXN）和硫氧还蛋白还原酶（Thioredoxin reductase, TXNRD或TrxR）两大部分。人体中TXNRD存在两种主要亚型：胞质型的TXNRD1和线粒体型的TXNRD2，两者都是含硒蛋白，以其C末端的硒代半胱氨酸（Sec）残基作为关键活性位点，成为许多亲电抑制剂的作用靶点。

先前的研究已鉴定出两种有效的TXNRD抑制剂——TRi-1和TRi-2。TRi-1对TXNRD1表现出较高的选择性，而TRi-2则能同时抑制两种亚型，但程度不同。然而，一个悬而未决的关键问题是：究竟抑制TXNRD1还是TXNRD2更能有效地杀死癌细胞？为了回答这个问题，并探索通过靶向线粒体来特异性抑制TXNRD2的可能性，来自塞尔维亚贝尔格莱德大学化学学院创新中心的研究团队开展了一项深入研究。他们合成了TRi-1和TRi-2的一系列新型类似物，其中包括设计用于在线粒体中富集的三苯基膦（Triphenyl phosphonium, TPP）衍生物，并首次系统评估了这些化合物的酶抑制活性和细胞毒性谱。这项研究成果发表在《Free Radical Biology and Medicine》上。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。在化学合成方面，他们采用了创新的合成路线，包括(3+2)环加成反应和铜催化的叠氮-炔烃环加成（Click Chemistry）反应，成功合成了11种目标化合物（MDJ系列），并通过核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HRMS）进行了结构确证，所有化合物纯度均高于95%。在生化分析中，他们使用纯化的重组人TXNRD1和TXNRD2蛋白，分别以DTNB和其天然底物硫氧还蛋白（TXN1/TXN2）耦合胰岛素还原为检测体系，测定了化合物抑制酶活的半数抑制浓度（IC₅₀）。在细胞生物学实验中，研究选用了两种人源癌细胞系：具有高NRF2活性和强抗氧化能力的肺腺癌细胞A549，以及NRF2活性和TXNRD1活性较低的头颈鳞癌细胞FaDu。通过Cell Titer Glo法检测细胞ATP含量来评估化合物处理24小时和48小时后的细胞毒性（IC₅₀）。此外，他们还利用一种高度特异性的荧光探针RX1检测了细胞内的TXNRD1活性变化，并使用了SecTRAP（Selenium-compromised Thioredoxin Reductase-derived Apoptotic Proteins）形成实验来评估抑制剂处理后的酶是否转化为促氧化的NADPH氧化酶。

研究结果丰富而具有启发性。在化学合成方面，研究人员成功开发了合成TRi-1和TRi-2类似物的新策略，特别是引入了炔烃基团，便于通过点击化学反应进行后续修饰，从而得到了包括TPP靶向衍生物和二聚体在内的多种新结构。

在生化特性分析中，所有新化合物都表现出对TXNRD1的抑制选择性高于TXNRD2。值得注意的是，含有完整TRi-1磺酰基团的类似物（如MDJ014, MDJ020）对TXNRD1的抑制效力与TRi-1相当甚至更强，而一旦移除该基团，抑制效力则大幅下降。源自TRi-2的类似物（如MDJ003, MDJ005, MDJ007, MDJ009）则普遍比TRi-2本身能更有效地抑制TXNRD2。引人注目的是，添加TPP基团（如MDJ005, MDJ009, MDJ016）普遍增强了化合物对TXNRD2的抑制效果。

在细胞毒性方面，化合物表现出多样化的效应。MDJ014（TRi-1类）和MDJ009（TRi-2类，含TPP）在A549细胞中展现出较低的微摩尔级IC₅₀值，意味着较强的细胞毒性。FaDu细胞对所有测试化合物都表现出比A549细胞更高的敏感性，这与它们较低的基础抗氧化能力相一致。当使用丁硫氨酸亚砜胺（BSO）耗竭细胞内的谷胱甘肽（GSH）后，所有化合物的细胞毒性均显著增强，尤其是TRi-1类的MDJ013和MDJ016，这表明它们的细胞毒效应与氧化应激密切相关，且可能涉及GSH依赖的解毒途径。

在细胞内的TXNRD1活性检测中，结果清晰地表明，含有TPP基团的化合物（MDJ005和MDJ016）在处理后几乎不影响胞浆中的TXNRD1活性（通过RX1探针检测），这强有力地证明了TPP基团成功地引导化合物避开了胞浆，靶向了线粒体。与此相对，不含TPP的对应化合物及TRi-1/TRi-2则能有效抑制胞浆TXNRD1的活性。

在SecTRAP形成能力方面，除MDJ016外，几乎所有测试的MDJ化合物都能与TXNRD1的Sec活性位点发生不可逆结合，并将被抑制的酶转化为具有促氧化活性的SecTRAPs。MDJ016是一个例外，它对TXNRD1的抑制是可逆的，这或许部分解释了其相对较低的细胞毒性。

最后，通过相关性分析发现，化合物对重组TXNRD2的抑制效力与其在A549细胞中48小时的细胞毒性之间存在显著的正相关关系（斯皮尔曼和皮尔逊相关系数rs/r ≈ 0.7）。然而，这种相关性并非绝对，表明除酶抑制外的其他因素，如细胞摄取、代谢和脱靶效应，也在最终细胞毒性中扮演重要角色。

综上所述，本研究成功地设计并合成了一系列基于TRi-1和TRi-2结构的新型TXNRD抑制剂。这些化合物展现了多样且有趣的生化活性和细胞毒性谱。研究证实，抑制TXNRD1足以引发癌细胞死亡，而通过引入TPP等靶向基团，可以实现化合物的亚细胞器特异性分布，从而潜在地调控其作用靶点和生物学效应。特别重要的是，研究发现FaDu等抗氧化防御能力较弱的癌细胞对TXNRD抑制剂更为敏感，这为针对特定基因背景的癌症进行精准治疗提供了理论依据。此外，研究所展示的合成策略（如点击化学）和评估框架（包括酶活抑制、多种细胞模型毒性测试、特异性活性探针和SecTRAP分析）为未来开发更具选择性和有效性的靶向硫氧还蛋白系统的抗癌药物提供了宝贵的蓝图和工具。这些发现不仅深化了对TXNRD1和TXNRD2生物学功能的理解，也推动了靶向氧化还原治疗在癌症领域的应用前景。